种质资源收集与评价岗位

刘崇怀 樊秀彩 张颖 孙磊

  无核分子标记的准确性大多在自然群体中进行验证，尽管已有多个与无核性状相关的分子标记被成功用于特定杂交群体，但验证效率与亲本关联度较高，在不同遗传背景下的鉴定效率尚不明晰，因此需要在其它遗传背景中测试其稳定性与适用性。本研究基于6个无核性状分子标记，以自然群体的157份种质和两个杂交群体的263份F1子代为试验材料，鉴定6个葡萄无核分子标记的准确率。分子标记p1_VvAGL11、p2_VvAGL11、p3_VvAGL11、5U_VviAGL11、VvSD10和KASP_VviAGL11在‘阳光玫瑰’ב红艳无核’杂交群体的无核鉴定准确率分别为70.90%、63.43%、74.63%、73.13%、76.12%和75.37%；在‘红地球’ב郑艳无核’杂交群体的无核鉴定准确率分别为87.60%、64.34%、89.92%、89.15%、91.47%和89.92%。根据自然群体的鉴定结果，KASP标记KASP_VviAGL11的A等位基因与无核表型100%相关。分子标记VvSD10和KASP_VviAGL11无核鉴定准确率高，综合表现最优，在葡萄无核性状分子标记辅助育种中可以优先使用。

  1 材料与方法

  试验材料共420份，包括68份无核种质和89份有核种质组成的自然群体保存于中国农业科学院郑州果树研究所国家葡萄种质资源圃；35份无核种质和99份有核种质组成的‘阳光玫瑰’ב红艳无核’F1代杂交群体保存于中国农业科学院郑州果树研究所基地；56份无核种质和73份有核种质组成的‘红地球’ב郑艳无核’F1代杂交群体保存于中国农业科学院郑州果树研究所基地。

  在葡萄果实成熟期调查种子性状，种子性状分类标准参照《葡萄种质资源描述规范和数据标准》，无核、软核与残核的单株均属于无核，种子充分发育的单株属于有核。

  取420份葡萄材料的健康幼嫩叶片，液氮研磨，采用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取叶片基因组DNA。选用5个SSR分子标记（表1）对263份试验材料进行准确率验证。含有FAM（5´-fluorescein-CE phosphoramidite）和HEX（5´-hexachloro fluorescein-CE phosphoramidite）两种荧光探针的SSR引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳确定模板浓度，稀释至工作浓度后采用荧光毛细管电泳仪（ABI 3730 xL 遗传分析仪）进行验证。

  KASP分子标记PCR扩增条件及基因型验证：KASP标记引物包括正向引物 Fa 和 Fb， Fa 引物用5'-荧光素-CE亚磷酰胺（FAM）染料特异性识别A等位基因； Fb 引物则使用5'-六氯荧光素-CE亚磷酰胺（HEX）染料特异性识别C等位基因。将正向引物Fa、Fb和反向通用引物R按1:1:3的比例混合制备KASP引物混合物。反应结束后，根据检测到的不同荧光信号来判断样本的基因分型情况。

  为了验证KASP_VviAGL11标记的基因型，采用常规PCR技术扩增位于Chr18: 26889269~26889678区域片段长度为410 bp 的DNA序列，然后进行桑格测序，以确认Chr18: 26889437位置的样本基因型与KASP_VviAGL11标记检测到的基因型一致。引物合成及测序由生工生物技术(上海)有限公司完成。

  数据处理：根据VIHINEN、BALDI和马亚茹等等计算4项指标：假阳性（False Positive，FP）、假阴性（False Negative，FN）、准确率（Accuracy）和无核检测率。假阳性表示样本携带无核等位基因，但不表现无核表型；假阴性表示不携带无核等位基因，却表现无核表型。准确率=（TP+TN）/（TP+FP+TN+FN），无核检测率=TP/（TP+FP）。为评估表型与分子标记数据之间的关联，利用R软件对分子标记的等位基因及基因型进行卡方（χ2）独立性检验（p＜0.05）。

  2 结果与分析

  2.1 SSR分子标记的等位基因检测及基因型分析

  使用5个SSR分子标记对两个杂交群体的F1代单株进行鉴定。结果显示：5个分子标记检测到的等位基因大小为101~318 bp，表现最好的等位基因如表4、表5所示，且无核等位基因均从无核父本遗传（表3）。分子标记p1_VvAGL11、p2_VvAGL11、p3_VvAGL11、5U_VviAGL11、VvSD10在携带相应等位基因的种质中，无核种质所占比例分别为63.6%、48.9%、68.0%、66.7%和70.3%。

  5个SSR分子标记中5U_VviAGL11检测到的基因型数量最多，每个标记表现最好的基因型如表6、表7所示。分子标记p1_VvAGL11、p2_VvAGL11、p3_VvAGL11、5U_VviAGL11、VvSD10在携带相应基因型的种质中，无核种质所占比例分别为69.8%、63.2%、80.1%、72.6%和84.0%。

  2.2 KASP分子标记的等位基因检测及基因型分析

  通过KASP标记对自然群体和两个杂交群体的F1代单株进行检测，KASP_VviAGL11检测到的A:A和A:C为无核基因型，C:C为有核基因型。如图2所示，KASP_VviAGL11标记在‘阳光玫瑰’ב红艳无核’杂交群体中的35份无核种质（A图）和99份有核种质（B图）中分别扩增出31个A:C基因型和70个C:C基因型；在‘红地球’ב郑艳无核’杂交群体中的56份无核种质（C图）和73份有核种质（D图）中分别扩增出52个A:C基因型和64个C:C基因型。在由157份二倍体葡萄种质组成自然群体中，68份无核种质（E图）均检测到A等位基因，基因型为A:C和A:A；89份有核种质（F图）均检测到C等位基因，基因型为C:C。

  2.3 不同类型分子标记准确率对比

  对6个SSR和KASP类型无核分子标记进行验证，由表8、表9可知，VvSD10的无核鉴定准确率和无核检测率最高，KASP_VviAGL11、p3_VvAGL11、5U_VviAGL11和p1_VvAGL11均有较高的无核鉴定准确率和无核检测率，同时也拥有较低的假阳性率和假阴性率。p2_VvAGL11的无核鉴定准确率和无核检测率最低。

  3 结论

  通过自然群体和‘阳光玫瑰’ב红艳无核’、‘红地球’ב郑艳无核’两个F1代杂交群体对6个无核分子标记进行验证，VvSD10和KASP_VviAGL11的无核鉴定准确率及无核检测率最高，综合表现最优，可作为辅助葡萄无核育种过程中的可靠标记。