育种方法与技术岗位

  葡萄常规染色体加倍体系普遍存在材料限制多、诱变效率低、高嵌合体率等问题，相比而言，秋水仙素诱导的组培腋芽加倍技术以组培无菌的腋芽为外植体具有材料全年可大量获得，方便纯化，周期短等优势。同时组培腋芽的再生能力强、成活率高，在嵌合体纯化后可快速获得大量四倍体植株，便于扩充育种基因库，增加遗传多样性，具体方法如下：

  1、试验材料与试剂

  该实验使用的葡萄品种为无核白；实验中主要用的药品包括MS培养基、生长素IBA、细胞分裂素6-BA、秋水仙素、NaOH等。

  2、实验步骤

  1.脱毒苗的获取

  将一年生葡萄苗的半木质化枝条剪下，流水冲洗10小时后，75%乙醇溶液消毒60s，10%次氯酸钠溶液消毒15min，无菌水清洗3遍后，移栽到启动培养基中。40天后转入生根培养基获得脱毒组培苗（图a）。

  3.共培养诱变

取葡萄组培苗的单芽茎段，分别接种在含有秋水仙素的MS培养基中培养（图b），72h后转移到MS培养基中继续培养成新的外植体（图c），试验重复3次，每个处理接种材料30个，于3周后调查存活率，连续观察变异情况。将存活的植株取嫩叶通过流式细胞术鉴定细胞倍性（图d）。

  4.继代纯化

  将鉴定后4倍体和嵌合体的外植体在MS培养基中进行继代培养，3代后再次使用流式细胞术鉴定倍性，从而获得性状稳定的突变体材料。将稳定的突变体材料使用组织培养的方式大量扩繁，并使用根尖染色法观察其染色体数量（图e）。

  5.移栽

  将扩繁后的葡萄幼苗生长40天后逐步拧开组培瓶，3天后移栽到营养土：蛭石1：1的基质中，保持湿度在80%以上，培养10天后逐步降低湿度至环境湿度，使其正常生长（图f），并观察其气孔和叶绿体情况（图g），最终我们获得了无核白葡萄四倍体株系50余株。

  结果显示，四倍体细胞中DNA含量相比于二倍体加倍了，根尖中染色体数量也同样进行了加倍。四倍体相对于二倍体葡萄，表现出了叶片变大变厚，节间缩短的明显的四倍体特征。四倍体相对于二倍体气孔直径增大，气孔密度降低，保卫细胞中叶绿体数量增多，本方法经过5个月成功地获得了无核白葡萄四倍体，且可以通过组培的方式不断扩繁获得大量的四倍体植株。