石家庄综合试验站

  葡萄霜霉病是严重危害葡萄生产的一大卵菌病害。引起霜霉病的葡萄霜霉菌(Plasmopara viticola) 是一种专性寄生卵菌，不同葡萄品种/种对霜霉菌的抗性存在着显著差异。欧洲葡萄(Vitis vinifera L.)易感霜霉病，而我国野生葡萄表现出对霜霉病的抗性。近年来 众多基因已被证实参与植物的防御反应，因此挖掘抗病葡萄品种中的抗病基因改良欧洲葡萄对于葡萄育种有着极其重要的意义。

  目前，摩尔多瓦品种在抗病性方面表现极佳，石家庄地区近乎免疫，甚至高于多个山葡萄与美洲种品种（普遍认为高抗）。同时，摩尔多瓦在果实方面表现优异，果实品质果粒大、果粉厚、品质上佳。成为筛选抗病、粒大、优质种质的优秀亲本资源。因此本研究计划选取摩尔多瓦与美人指开展室内霜霉病接菌试验，并观察接种后0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h时两个品种的发病情况。并依据结果选取时间段进行转录组+代谢组测序。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  试材为高感品种美人指和高抗品种摩尔多瓦，2个品种均定植在河北省农林科学院石家庄果树研究所葡萄试验园连栋冷棚内，篱架栽培，5年生植株。试验叶片取自一年生新梢由上往下的第3～5片成熟叶片。

  试验菌种采自葡萄试验园内的混合菌。采集初发霜霉病的叶片，用无菌水冲洗干净后，在光照培养箱内( 18～20 ℃，16 h光照，8 h黑暗) 培养 2～3 d，长出白色菌层。

  1.2 试验方法

  1.2.1 室内离体接菌

  将采集的叶片用无菌水洗干净，在超净工作台内用无菌滤纸吸干水分，背面向上均匀铺在 1% 水琼脂培养基上。将培养皿置于培养箱中18～20 ℃黑暗培养24 h。在超净工作台中用灭菌滤纸条把水滴吸干，喷洒无菌水保湿，重新置于培养箱中，18～20 ℃，16 h光照，8 h黑暗培养。

  1.2.2 采样及样品保存

  在接菌0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h后分别取出 3 皿，把叶片用液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱保存。

  1.2.3 转录组与代谢组测序

  监测0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h（接种后）的感染情况，研究抗性（摩尔多瓦）和敏感（美人指）葡萄在感染周期中的宿主反应。选择不同时间段的叶片进行转录组与代谢组测序。

  2 结果与分析

  2.1 表型观察

  监测0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h（接种后）的感染情况，研究抗性（摩尔多瓦）和敏感（美人指）葡萄在感染周期中的宿主反应。结果表明，摩尔多瓦与美人指对霜霉菌的抗性差异较大，而摩尔多瓦对霜霉菌的抗性较高。在美人指中，96h叶片上已经出现了少量霉菌。与摩尔多瓦相比，在120h时，美人指中出现了更严重的疾病症状，其特征是每片叶子上的霉菌层越来越大。

  2.2 代谢组分析

  为进一步阐明葡萄霜霉菌感染的生理机制，在UPLC-MS/MS平台上进行了摩尔多瓦叶片和美人指叶片（0h、24h、48h）的代谢变化分析。主成分分析（PCA）表明，除SD24h与SD48相对接近外，6组叶片样品被PC1和PC2明显分离。6个样品共鉴定出1800种代谢物，分为13类，主要是类黄酮类、酚酸、萜类、脂类、木酚素和香豆素等，其余类分为“其他”组。

  为了深入了解六组间代谢物的变化，两两比较之间的VIP≥1和≥2或≤0.5，以及 P值<为0.05，用于鉴别差异积累代谢物（DAMs）。差异代谢物分析结果显示，葡萄霜霉菌侵染后分别有356个（RD24h_vs_RD0h）、305个（RD48h_vs_RD0h）、304个（RD48h_vs_RD24h）、294个（SD24h_vs_SD0h）、294个（SD48h_vs_SD0h）、197个（SD48h_vs_SD24h）、598个（RD24h_vs_SD24h）、669个（RD48h_vs_SD48h）代谢物发生显著变化。同时，我们对6组的不同组合进行了维恩分析。结果表明，通过RD24h_vs_RD0h和RD24h_vs_SD24h、RD48h_vs_RD0h和RD48h_vs_SD48h的比较得到149和156个，主要含有类黄酮、芪类、萜类。结果表明，从上述6个组中同时鉴定出45个dem，主要含有12个黄酮类、11个芪类、6个酚酸类和6个萜类。值得注意的是，虽然表明两个品种的这些代谢物对葡萄霜霉菌的感染均有响应，但含量的差异导致了抗性的差异，特别是，脱落酸、转白藜芦醇、白藜芦醇及其衍生物、茉莉酸的含量存在较大差异。

  2.3 转录组分析

  为进一步阐明葡萄对霜霉菌侵染的分子机制，对0、24、48h（每阶段3个生物重复）的叶片进行了测序，构建了18个cDNA文库。去除低质量数据后，获得了约149.95g（Gb）的clean date，每个样本的平均clean date约为8.33 Gb。18个文库的GC含量（%）为45.78%~46.94%，Q30%的最小值为92.81%。超过93%的clean reads与葡萄参考基因组相匹配，上图率从93.86%~95.62%不等，唯一上图率从90.39%~92.29%不等。这些结果表明，测序数据的准确性和质量高度满足了进一步分析的需要。

  根据每对基因之间的绝对log2基因比率≥2和FDR < 0.05，筛选出1450个基因（RD24h_vs_RD0h和RD24h_vs_SD24h）、1692个基因（RD48h_vs_RD0h和RD48h_vs_SD48h），并在每对比较中鉴定为deg。结合上述数据，共鉴定出2462个DEGs。为了进一步评估这些DEGs的生物学功能，我们进行了GO和KEGG通路富集分析。根据GO数据库，GO富集结果表明，这些DGEs主要富集于生物过程、细胞成分和分子功能等方面。在生物过程类别中，大多数DEGs被注释为“细胞对化学刺激的反应（GO：0070887）”、“生物合成过程的调节（GO：0009889）”、“对非生物刺激的反应（GO：0071214）”、“RNA代谢过程（GO：0016070）”和“有机物质运输（GO：0071702）”。在细胞成分类别方面，DEGs主要富集于“质膜部分（GO：0044459）”、“内质网部分（GO：0044432）”、“高尔基膜（GO：0000139）”等。在分子功能类别中，DEGs主要富集于“转录调节活性（GO：0140110）”，其次是“dna结合转录因子活性（GO：0000981）”“水解酶活性，作用于糖基键（GO：0016798）”。

  此外，为了探索参与抗病响应调控的关键基因，我们还对DEGs进行了KEGG注释。KEGG注释显示，RD24h_vs_RD0h组之间富集141条通路，共富集2139条；RD48h_vs_RD0h组2296个富集140条通路，RD24h_vs_SD24h组1220条富集132条通路富集，1280条富集RD48_vs_SD48组133条通路。根据各组显著富集的途径统计，最显著的途径包括植物-病原体相互作用（ko04626）、次生代谢产物生物合成（ko01110）、代谢途径（ko01100）、植物激素信号转导（ko04075）。

  植物-病原体互作通路中，环核苷酸门控离子通道（CNGC1和CNGC2）、受体蛋白7(RLP 7）、富亮氨酸重复受体蛋白激酶（EMS）、衰老相关羧酸酯酶（SG）、壁相关受体激酶（WAK）、抗病蛋白（DRL）、EIX受体（EIX1）等。在MAPK信号通路中，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（SRK2）、脱落酸受体（PYL4）、病程相关蛋白（PR1）、钙调蛋白（CML）、LRR受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（LRR）的基因表达也存在差异。在植物激素信号转导途径中，主要是生长素应答蛋白（SAUR7），脱落酸不敏感蛋白（AI5L5）。除参与霜霉病应答的基因途径外，如病原体相关蛋白4（PR4）、病原体相关蛋白（PRPX7）己糖基转移酶（GOLS1），这些基因在侵染过程中均存在表达差异。

  3.结论

  本研究室前期对多个鲜食葡萄品种进行了霜霉病菌的抗性分析，本研究选取了高抗品种摩尔多瓦和高感品种美人指为试验材料，离体接菌后观察其表型，分析2个品种响应葡萄霜霉菌侵染方式的差异。通过转录组与代谢组测序技术筛选出2个品种间的差异代谢物与差异表达基因，并对其进行GO和KEGG的注释与富集分析，从两个水平研究了葡萄响应葡萄霜霉菌侵染的分子机制，本结果以期为葡萄抗病分子育种提供理论基础。