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基于代谢组学的‘黑皇’葡萄双季果挥发性差异代谢物分析 [2025/7/10 21:46:00] 来源: 作者:Admin

南宁综合试验站黄

桂媛 郭荣荣 程昌富 时晓芳 盘丰平 韩佳宇 林玲 张瑛

 

   :为研究一年两收栽培模式下,夏季葡萄果实(SF)和冬季葡萄果实(WF)挥发性香气代谢物的差异, 本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术,基于SIM模式对黑皇葡萄挥发性香气代谢物进行了分析。夏季和冬季葡萄果实共检测到602种挥发性化合物,其中主要为萜类化合物,其次是酯类、杂环等化合物。WFSF间萜类、酮类和烃类化合物的含量差异较大,显著差异代谢物有21种,其中上调表达的代谢物10 种,下调表达11种。SFWF积累了更高浓度的萜类物质,表明黑皇葡萄中萜类物质的代谢对气候条件的响应表现出其品种特异性。该研究风味组学分析显示,果香和甜味是黑皇葡萄果实最关键的香气风味,相关物质为(Z)-3-己烯醛、苯甲醛、香茅醛、1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-)-2-丁烯-1-酮、1-(4-甲氧基苯基)-2-丙烷酮。本研究丰富了双季葡萄挥发性香气物质代谢理论,为选择适合一年两收栽培的香气品种提供参考依据。


  关键词:黑皇葡萄;一年两收栽培;代谢组学分析;香气成分

 

  葡萄是世界范围内最受欢迎的水果作物之一,可鲜食、酿酒、制干、制汁等,具有重要的经济价值。我国南方地区为亚热带湿润季风性气候,夏季高温多雨,冬季温和少雨,葡萄生产中广泛采用一年两收栽培模式。两季果生长发育期间气候条件的差异会导致夏季果实和冬季果实代谢存在差异。挥发性香气物质作为葡萄果实中重要的次级代谢产物,是葡萄果实和葡萄酒品质的重要组成部分,也是评估果实成熟度及商品价值与市场吸引力的关键指标。研究发现夏黑葡萄冬季果的香气化合物种类和含量均高于夏季果。在葡萄中鉴定的几百种挥发性化合物中,最重要的挥发性化合物家族是萜烯类、醛类、醇类、吡嗪类、挥发性脂肪族、芳香族和挥发性硫化物。其中,萜类化合物在大多数鲜食葡萄的特色香气中具有不可替代的作用。萜烯、C13-降异戊二烯类和非萜烯醇是葡萄中重要的香气化合物,赋予果实花香和果香。葡萄果实发育过程中,香气物质既受到品种基因型的影响,也受到温度、光照、水分等外在气候条件的影响。 例如,里哪醇和香叶醇是雷司令的主要特征性香气物质,巨玫瑰主要挥发性香气物质为 己醛、2-己烯醛、己醇、2-己烯-1-醇等。前人研究表明,冷凉气候有助于葡萄果实中C6醛类和降异戊二烯类化合物的积累,而温暖地区的葡萄果实具有更高的萜类物质,高温通常会降低葡萄的芳香品质。此外,也有研究发现葡萄果实成熟期增加曝光可促进萜烯类物质的积累,而遮光会使萜类物质、醛、酮及醇类化合物含量降低。因此,温度和光照是影响挥发性香气物质的重要气候因素。水分也是影响葡萄发育的另一个重要生态因子,适度的水分胁迫可以增加葡萄果实中挥发性物质的种类和含量。Song等发现干旱胁迫有利于美乐葡萄果实中萜烯类化合物含量的积累。


  目前,关于一年两收栽培模式下葡萄挥发性香气物质的研究报道较少。黑皇葡萄是由巨 峰玫瑰蓓蕾杂交选育而成的三倍体无核鲜食葡萄品种,坐果率高,果实呈深紫色,具有玫瑰和麝香混合风味,适合一年两收栽培。本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术检测黑皇葡萄双季果实中的挥发性香气物质的种类和含量,并通过差异分析筛选其特征香气成分,为后续黑皇葡萄的开发利用和香气改良提供科学依据。


  1  材料与方法


  1.1 试验材料


  本研究以3年生黑皇葡萄为试材,种植于广西南宁市广西农业科学院葡萄与葡萄酒研 究所葡萄基地(22°36'39"N108°13'51"E)。采用简易避雨双十字V型架栽培模式种植,南北行向,株行距为1.5 m×2.5 m。采用夏季果与冬季果一年两收栽培模式。2022715日收获第一季果(夏果,SF),202312日收获第二季果(冬果,WF)。


  1.2 样本制备与处理


  试验设置6个生物学重复,每个生物学重复选择生长状况一致的6穗葡萄,从每穗果上中下三个部位各取1粒混合后放入50 mL离心管,液氮速冻,﹣80 ℃保存备用。整个果实样品在液氮中研磨成粉末,取500 mg粉末转移到20 mL顶空瓶(Agilent)中,加入饱和氯化钠溶液,用带有TFE-硅酮顶空隔垫(Agilent)的卷边瓶盖密封。在进行SPME分析时,每个顶空瓶在60 ℃ 下放置5 min,然后120 μmDVB/CWR/PDMS纤维(Agilent)在60 ℃条件下于样本的顶空暴露15 min


  1.3 气相色谱-质谱联用条件


  挥发性香气物质的鉴定和定量采用安捷伦8890GC7000D质谱仪(Agilent),配备

DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm, Agilent),以高纯氦气作为载气(纯度不小于

99.999%),流速1.2 mL·min-1,进样口温度保持在250 ℃。柱温箱升温程序:40 ℃保持3.5 min,然后以10 ℃·min-1升至100 ℃,再以7 ℃·min-1升至180 ℃,最后以25 ℃·min-1升至280 ℃后,保持5 min。质谱采用电子能量70 eV的电子轰击离子源(EI)模式,离子源、四级杆和质谱接口温度分别为230 ℃150 ℃280 ℃。采用选择性离子检测模式(SIM)对挥发性有机物进行定性定量分析。


  1.4 数据分析


  1.4.1 代谢物主成分与聚类分析


  运用R语言(www.r-project.org)当中的统计函数 prcomp 施行无监督的主成分分析(Principal Component AnalysisPCA)。在开展无监督的PCA操作前,针对数据实施单位方差缩放处理。代谢物含量数据采用UVunit variance scaling)归一化处理,通过R软件ComplexHeatmap包绘制热图。


  1.4.2 差异代谢物的筛选


  针对两组分析而言,差异代谢物通过变量投影重要性(VIPVIP1)以及绝对Log2倍变化值(|Log2FC|≥1.0)予以明确。VIP值从OPLSDA结果当中提取,OPLS-DA 结果还涵盖得分图与排列图,利用RMetaboAnalystR生成。在进OPLS-DA 之前,数据进行对数转换(log)和均值中心化处理。


  1.4.3 KEGG注释和富集分析


  使用KEGG化合物数据库(http://www.kegg. jp/kegg/compound/)对已鉴定的代谢物进行注释,将注释的代谢物映射到KEGG通路数据库(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)。将具有显著调节的代谢物映射通路输入至 MSEA(代谢物富集分析)之中,其显著性通过超几何检验的P值来判定。


  2 结果与分析


  2.1 代谢产物鉴定与分类


  ‘黑皇葡萄两季果均检测到602种挥发性化合物,两季果实挥发性物质种类没有差异,均包括萜类114种,酯类112种,杂环化合物95种,烃类60种,酮49种,醇47种,醛46种,芳烃31种,酸13种,胺11种,酚8种,氮化合物7种,卤代烃3种,含硫化合物2种和其他类化合物4种。因此萜类化合物最为丰富(18.94%),其次是酯类(18.60%)、杂环化合物(15.78%)和烃类化合物(9.97%)(图1A)。主成分分析揭示了样本组间代谢物的总体差异以及样本组内的变异性。主成分1和主成分2分别解释了样本间总方差的35.92%20.01%(图1B),SFWF代谢物存在差异。

 


  2.2 差异代谢物筛选


  根据OPLS-DA模型分析代谢组数据,基于VIP≥1初步筛选出SFWF间的差异代谢物,结合|Log2FC|≥1进一步筛选差异特征代谢物。WFSF间的差异代谢产物共21个,相对于SFWF中上调表达的代谢物10个,下调表达的代谢物11 个(图2A,表1)。进一步对差异代谢产物进行分类,包括8类:酮(5个)、萜类(4个)、烃(3个)、醛(2个)、杂环化合物(2个)、酯(2个)、芳烃(2个)、醇(1个),其中萜类主要为下调表达,酮、醇主要为上调表达,而烃均为下调表达(表1)。WFSF中差异倍数前20代谢物结果如图2B所示,其中Log2FC最大的上调物质为芳烃类化合物 (1-甲基-1-丙基戊基)-苯(Benzene(1-methyl-1-propylpentyl)-),最大的下调物质为芳烃类化合物4a,4b-二甲基-2,7-(-2-)-1,2,7,8,8a,8b-六氢联苯(.alpha.-Phellandrenedimer)。

 

 

  2.3 差异代谢物KEGG富集分析


  代谢物在生物体内相互作用,形成不同的通路。SFWF之间的21种差异代谢产物中有3种差异显著代谢产物主要在次生代谢物生物合成(Biosynthesis of secondary metabolites ko01110)、代谢途径(Metabolic pathwaysko01100 ) 、 倍半萜类和三萜类生物合成 (Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesisko00909)、亚麻酸代谢(alpha-Linolenic acid metabolismko00592)中被注释和富集(图3,表1)。这3种差异代谢物分别为醛类的(Z)-3-己烯醛和苯甲醛,萜类的δ-杜松烯(表1)。

 


  2.4 差异代谢物风味组学分析


  香气成分能够客观地反映不同样本的风味点,是评价风味品质的重要指标。对各差异比较组中基于筛选标准鉴定得到的差异代谢物及注释到的感官风味特征,注释个数最高的前10个感官风味分别是果香(fruity3种)、甜味(sweet3种)、花香(floral3种)、辛辣味(spicy2种)、青果香(green2种)、香草味(balsamic2种)、干型(dry2种)、脂香味(fatty2种)、草本香(herbal2种)和柑橘味(citrus1种)。甜味、花香、干型、草本香、柑橘味在SF中更为突出,与SF相比,WF的水果气味以果香最为突出,其次是青果香。相应的感官风味特征的差异代谢物为:1-(4-甲氧基苯基)-2-丙烷酮、1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-)-2-丁烯-1-酮、(Z)-3-己烯醛、苯甲醛、香茅醛、 4-(1,5-二甲基-1,4-己二烯基)-1-甲基-环己烯、肉豆蔻酸异丙酯、δ-杜松烯,对应关系见图4。 相对于SFWF除了前3个代谢物产量上调,其余均表现为下调,表明1-(4-甲氧基苯基)-2-丙烷酮、1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-)-2-丁烯-1-酮、(Z)-3-己烯醛为WF主要风味代谢物(图4,表1)。苯甲醛、香茅醛、4-(1,5-二甲基-1,4-己二烯基)-1-甲基-环己烯、肉豆蔻酸异丙酯和δ-杜松烯为SF主要风味代谢物(图4,表1)。

 


  3 讨论与结论


  挥发性香气物质是葡萄果实中重要的次级代谢物,其合成代谢受到葡萄品种的基因型、生长发育时期和生长季节等因素的影响。在一年两收的栽培模式下,虽然两季果生长季节之间的物候期差异较大,但是本研究中黑皇夏果和冬果中的挥发性化合物的种类没有区别,这主要是由黑皇葡萄品种的基因型决定的,这与Camara等的研究结果相一致。萜类为黑皇葡萄最主要的挥发性化合物,这与文献报道的玫瑰香等麝香型葡萄品种中通常含有大量的萜类物质相一致,萜类物质感官阈值较低,赋予葡萄花香、果香。


  差异代谢物比较分析发现,萜类和烃在夏果中以上调为主,如萜类的4-(1,5-二甲基-1,4-己二烯基)-1-甲基-环己烯(4-(1,5-dimethyl-1,4-hexadienyl)-1-methyl-Cyclohexene),烃类的9-甲基-1-十一碳烯(1-Undecene, 9-methyl-)。而冬果(WF)中以酮、醇类物质上调为主,如酮类的4-甲基-3-戊烯-2-酮(3-Penten-2-one, 4-methyl-),醇类的1,2-苯二甲醇(1,2-Benzenedimethanol)。葡萄萜类物质的代谢受品种、发育时期和生长季等因素的影响。一般而言,大部分游离态香气物质在冬季葡萄果实中的含量更高,但是各香气物质在两季果中的分布还受到品种以及年份的影响。其中萜烯类物质受生长季节的影响较大,并且表现出品种的特异性。Lu等的研究表明,在一年两收栽培模式下,雷司令Riesling)、维多利亚Victoria)和玫瑰香Muscat Hamburg)葡萄在2014—2015年两个年份中,冬季果实的萜烯类、降异戊二烯类(norisoprenoids)和C6/C9化合物浓度均显著高于夏季果实。然而,对于赤霞珠Cabernet Sauvignon)葡萄,仅在2014年冬季果实中观察到萜烯类浓度高于夏季的现象。本研究中,黑皇葡萄的夏果比冬果积累了更高浓度的萜类物质,表明葡萄中萜类物质的代谢对气候条件的响应表现出品种特异性。综上所述,对于黑皇葡萄,夏果对萜类物质的积累较好,而冬果对酮、醇类物质的积累较好。


  影响葡萄果实风味物质的主要因素包括品种的基因型、生态因子和栽培模式等。香气是大量游离挥发性化合物的复杂混合物,其成分因葡萄品种而异。不同的葡萄果实因香气挥发性化合物的种类、含量和组成比例不同而呈现出不同的香气风味。黑皇葡萄夏果的重要风味特征包括甜味、花香、干型、草本香和柑橘味。相比之下,冬果的果香最为突出,其次是青果香。这表明同一葡萄品种的浆果在感官特性上存在明显的季节差异。黑皇葡萄夏季和冬季果实共602种挥发性化合物,主要特征挥发性化合物是萜类,其次是酯类。夏季和冬季生长季节气候因子的差异导致冬果与夏果间萜类、酮类和烃类化合物的含量差异较大,显著差异代谢物有21种。虽然夏季生长期有较高的活跃积温但在黑皇葡萄夏果中仍然积累了更高浓度的萜类物质,表现出品种特异性。风味组学分析显示,黑皇葡萄最重要的感官风味是果香、甜味、花香、辛辣味、青果香、香草味、干型、脂香味、草本香和柑橘味。其中果香和甜味是最关键的香气。甜味、花香、干型、草本香、柑橘味在夏果中更为突出,冬果以果香最为突出,其次是青果香。研究结果阐明双季黑皇葡萄果实挥发性香气物质的特征,为科学控制葡萄香气和提高葡萄品质提供理论依据。