育种方法与技术岗位

  葡萄转基因功能验证中，稳定转化通常需较长时间，且转化效率低，是目前在分子层面研究葡萄基因功能的重要阻碍。原生质体由于易吸收外源物质而被广泛应用于瞬时的遗传转化系统，对快速鉴定葡萄基因功能具有重要作用，建立高效的原生质体分离体系和瞬时转化体系具有重要意义。实验室葡萄原生质体瞬时转化实验可采用以下技术方法。

  1、材料选择与药品试剂

  选择葡萄幼嫩叶片或愈伤组织作为实验材料，通常使用无核白、霞多丽、玫瑰香等品种开展实验处理的步骤基本相同。实验中主要用的药品和试剂包括纤维酶素、离析酶、mannitol、NaCl、KCl、MES、CaCl2、MgCl2、PEG4000等。

  2、实验步骤

  (1) 取生长4-5周的葡萄组培苗1-3片真叶，将叶子剪下，用刀片切成0.5–1 mm细丝，将其快速放入酶液 (1.5% cellulase R10，0.4% macerozyme R10，0.4 M mannitol，20 mM KCL，20 mM MES，10 mM CaCl2，pH=7.5)；或取适量葡萄愈伤组织，将其快速放入酶液，轻轻捣碎。室温下，在黑暗中继续消化2-3h，每隔1h轻轻摇动酶液。在显微镜下检测原生质体完整性。

  (2) 用W5溶液 (154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl，2 mM MES，PH=5.7)润湿75毫米尼龙网后，过滤含有原生质体的酶溶液。用圆底离心管，离心100 g ，3 min。用W5溶液清洗1次，每次混匀要轻柔，弃上清后再加入20-30 mL W5溶液，置于冰上恢复原生质体至少30 min。原生质体自动沉降后，弃去上清。在显微镜下对原生质体进行计数，用5mL左右MMG溶液 (0.4 M mannitol，15 mM MgCl2，4 mM MES，PH=5.7) 重悬至原生质体终浓度约为2×105 ml–1。

  (3) 2 mL离心管中依次加入10-20μg待转质粒、110μL原生质体和160 μL PEG (40% PEG4000，0.2 M mannitol，100 mM CaCl2)，轻轻敲击试管完全混合，室温放置10min。

  (4) 室温下，加入500 uL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置试管以停止转染过程，室温下离心100 g，2 min，除上清液；重复四次。

  (5) 用1 mL WI溶液 (154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl，2 mM MES) 轻柔重悬原生质体后放到六孔细胞培养板中，在室温下培养原生质体12-18 h，显微镜观察。