种苗扩繁与生产技术

  摘要：山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是属于东亚种群的野生葡萄，具有优良的的抗寒性和抗病性以及良好的酿酒潜力。类黄酮是葡萄中重要的次生代谢产物，对葡萄和葡萄酒的颜色和风味有重要的作用。为探究山葡萄的类黄酮化合物，采用HPLC-QqQ-MS/MS对来自两个地区（中国吉林左家和集安）的5个山葡萄和 3个山-欧杂种葡萄进行了鉴定和分析。结果表明，与山-欧杂种葡萄相比，山葡萄的花色苷含量较高，但黄烷醇含量较低。山葡萄的显著特点是含有花青素双糖苷，而不含酰化花色苷。就地区而言，左家气候凉爽，土壤肥沃，种植的葡萄含有较多的黄酮醇和黄烷醇，而集安气温较高，降水较多，种植的葡萄含有较多的花色苷。在本研究中，黄酮醇是受气候和土壤因素影响最大的类黄酮化合物，它们大多与温度和降雨量呈负相关，而与日照时数和大多数土壤养分指标呈正相关。本研究结果可为葡萄品种的利用提供理论依据，并有助于新种质资源的开发。

  关键词：山葡萄；中国野生葡萄；花色苷；黄酮醇；黄烷醇；风土

  山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是属于东亚种群的野生葡萄品种，原产于中国，主要分布在中国、韩国和俄罗斯。山葡萄具有优良的抗寒性（可在-40 °C下存活），主要种植在亚洲东北部的寒冷地区 (Liu and Li, 2013; Tian et al., 2024)。此外，山葡萄对炭疽病和白腐病等各种葡萄病害也有很强的抗性，因此通常被用作砧木和育种材料以增强葡萄栽培品种的抗寒性和抗病性 (Li et al., 2024)。与欧亚种葡萄相比，山葡萄的含糖量较低，酸度和多酚含量较高 (Zhu et al., 2021)。用山葡萄酿造的葡萄酒色泽更深、香气宜人、口感醇厚，与欧亚种葡萄酿造的葡萄酒具有一定差别 (Li et al., 2017; Liu and Li, 2013)，这些独特特性使山葡萄越来越受到研究人员的青睐。

  葡萄浆果含有大量的次生代谢物，其中类黄酮对葡萄和葡萄酒的品质起着至关重要的作用，对葡萄的色泽、口感和健康特性有重要作用 (Shi et al., 2024)。葡萄中的类黄酮化合物主要包括花色苷、黄酮醇、黄烷醇等。花色苷对葡萄和葡萄酒的颜色起着基础作用 (He et al., 2010)，其含量、类型和比例与葡萄和葡萄酒的红色密切相关 (Zhang et al., 2018)。此外，花色苷还具有多种生物学作用，如抵御太阳照射和紫外线辐射、抗氧化能力、抗炎活性、预防癌症和心血管疾病等 (He et al., 2010; Sabra et al., 2021; Trikas et al., 2016)。例如，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷通过抑制环氧化酶同工酶的活性而具有抗炎活性，并与其他二甲花翠素衍生物具有协同作用 (Sabra et al., 2021)。黄酮醇主要存在于葡萄浆果的果皮中，是葡萄酒中花色苷的辅色素 (Koyama et al., 2017)。它们还具有明显的抗氧化作用，并作为光保护剂保护浆果免受紫外线辐射 (Liang et al., 2012b)。黄烷醇存在于葡萄皮和葡萄籽中，是葡萄单宁的基本组成成分，赋予了葡萄酒涩感 (Koyama et al., 2017)。

  葡萄中类黄酮化合物的浓度和组成受基因控制。与欧亚种葡萄相比，山葡萄富含花色苷，但黄酮醇和黄烷醇含量较少 (Hilbert et al., 2015; Liang et al., 2012b; Zhu et al., 2021)，这导致用山葡萄酿造的葡萄酒颜色更深，但稳定性更差。此外，山葡萄富含花青素双糖苷，不含酰化花青素 (Li et al., 2021)，使其有别于欧亚种葡萄。气候、土壤成分和种植方法也会对葡萄中的类黄酮成分产生影响 (Vilanova et al., 2015)，类黄酮的分布因地理区域和气候特征的差异而不同 (Zhang et al., 2024)。

  目前，山葡萄在中国发展迅速，更多具有优良特性的山葡萄品种被培育出来并用于酿造不同类型的葡萄酒。然而，有关不同山葡萄品种类黄酮化合物的文献有限，这将限制其在葡萄酒酿造中的应用。同时，山葡萄和欧亚种葡萄杂交品种的特征尚不明确，它们是否继承了山葡萄和欧亚种葡萄的类黄酮特征还需要进一步探索。此外，由于风土对葡萄成分的影响很大，不同地区的风土条件对类黄酮化合物的影响也值得进一步研究。在这项研究中，我们连续三年（2020-2022年）从两个地区采集了五个山葡萄品种和三个山-欧杂种葡萄的浆果。使用HPLC-QqQ-MS/MS分析了葡萄中的类黄酮物质，筛选出不同葡萄品种中的特征类黄酮物质，并研究了类黄酮与环境因素之间的联系。研究假设不同的葡萄品种表现出不同的类黄酮特性，气候和土壤对类黄酮特性的形成有一定的影响。该研究的目的是揭示不同山葡萄品种的类黄酮特性，为其进一步发展和利用提供实验支持。

  1 材料与方法

  1.1 实验材料

  这项为期三年（2020-2022年）的研究在中国吉林省左家和集安的两个葡萄园中进行。在商业采收期，对两地的五个山葡萄品种（BGH、BGL、SF、SH和 SY）和三个山-欧杂种葡萄（BBH、XLH 和 ZYH）进行采样，葡萄品种和葡萄园的基本信息已在之前的研究中进行了描述 (Li et al., 2024)，这些葡萄栽培品种已通过SSR进行了葡萄栽培品种特性鉴定，所有葡萄品种均采用VSP系统种植，株行距为1 m×2.5 m。在成熟期随机从树冠两侧的10棵不同葡萄树上采集300个浆果为一个生物学重复，共三个生物学重复，储存在-80 °C的冰箱。两个不同地区的气象数据，包括温度（°C）、GDD（°C）、日照时数（h）和降雨量（mm）均来自当地气象站，简而言之，集安的温度和GDD均高于左家，而左家的日照时数和降水量均高于集安，土壤也比集安肥沃。

  1.2 类黄酮物质分析

  葡萄果实类黄酮物质的提取和检测采用实验室统一方法 (Liang et al. 2012a; Wang et al., 2021)。

  2 结果与分析

  2.1 葡萄中的花色苷

  在左家和集安三个年份的不同葡萄品种中，共检测到29种花色苷，含量范围在133.87至1195.69 mg/kg FW之间（图 1）。与其他葡萄品种相比，BGL、SF和SH的花色苷总浓度较高，而XLH的花色苷总浓度最低。此外，山葡萄的花色苷总浓度高于山-欧杂种葡萄。就地区而言，集安葡萄的花色苷总浓度高于左家葡萄。

  为了解不同山葡萄和山-欧杂种葡萄的花色苷特征，我们根据花色苷的结构将其分为不同类型。在不同葡萄品种中检测到了6种花青素（Cy）、5种甲基花青素（Pn）、6种花翠素（Dp）、6种甲基花翠素（Pt）和6种二甲花翠素（Mv）衍生物。在所有花色苷衍生物中，Mv衍生物在所有葡萄品种中含量最高（图 2a）。在Mv衍生物中，二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷在山葡萄中占主导地位，而二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷是BBH和XLH中最主要的花色苷（2021年集安葡萄除外）。在这五种花色苷中，Pn衍生物的浓度低于其他衍生物，所占比例从 3.21%（SF）到 7.01%（BBH）不等。除了花青素单糖苷外，在山葡萄和山-欧杂种葡萄中还检测到了花青素双糖苷。在山葡萄中，花青素双糖苷占主导地位，占总花色苷浓度的 77.55-86.55%。而在山-欧杂种葡萄BBH和XLH中，花青素单糖苷的含量高于花青素双糖苷（图 2b）。花色苷还可根据是否酰化分为非酰化和酰化花色苷，酰化花色苷又可分为乙酰化和香豆酰化花色苷。本研究发现，所有山葡萄都没有检测到酰化花色苷，如图 2c 所示，在BBH和XLH中检测到了乙酰化和香豆酰化花色苷，但只占一小部分。乙酰化花色苷是BBH 中含量最高的酰化花色苷，二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷是主要的酰化花色苷。而在XLH中，酰化花色苷主要是香豆酰化的，其中二甲花翠素-3-O-香豆酰花色苷是最丰富的酰化花色苷。此外，这些花色苷还可根据其分子B环上羟基和甲氧基取代基的位置和数量进行分类。结果表明，3’5’-羟基化的花色苷是所有葡萄品种中的主要形式，比例从75.16%（ZYH）到91.53%（BGH）不等（图 2d）。甲基化衍生物在所有葡萄中都占主导地位，其中SY所占比例最高（82.25%），BGL所占比例最低（53.35%）（图 2e）。

  2.2 葡萄中的黄酮醇

  如图1b所示，不同葡萄品种中总黄酮醇的浓度在18.89至172.41 mg/kg FW 之间。XLH的总黄酮醇含量最高，尤其是左家的葡萄。此外，在所有葡萄品种中，BBH和BGH的总黄酮醇含量相对较高，但SY的含量最低。本研究共检测出16种黄酮醇，槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸和杨梅酮-3-O-葡萄糖苷是所有葡萄品种中的主要黄酮醇，占总黄酮醇浓度的绝大部分。在ZYH 中，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的比例小于其他两种黄酮醇，而在BBH、XLH和 SY中，杨梅酮-3-O-葡萄糖苷的比例相对较小。然而，在其他葡萄品种中，这三种黄酮的比例在不同年份和不同地区有所不同。此外，只有在BBH和XLH中检测到了槲皮素-3-O-芸香糖苷。在地区方面，左家葡萄中黄酮醇的总浓度高于同一年份的集安葡萄。

  根据生物合成途径和分子结构，这些黄酮醇被分为六类：杨梅酮（My）、槲皮素（Qu）、山奈酚（Ka）、异鼠李素（Is）、西伯利亚落叶松黄酮（La）和丁香亭（Sy），如图 2f所示。Qu-衍生物是所有葡萄品种中含量最高的黄酮醇，其中 XLH所占比例最高（80.55%），SF所占比例最低（50.34%）。其次是My-衍生物，在SF中的比例最高，为44.17%，在SY中的比例最低，为10.63%。其他四种黄酮醇衍生物只占所有葡萄的一小部分。在这四种黄酮醇中，Ka-和Is-衍生物在BBH中的比例最高，而Sy-和La-衍生物在SY中的比例较高。

  2.3 葡萄中的黄烷醇

  葡萄果实中黄烷醇的总浓度高于花色苷和黄酮醇，表明黄烷醇是葡萄中最主要的类黄酮化合物。葡萄果皮黄烷醇的总浓度在不同年份、地区和栽培品种之间存在很大差异，从52.89到5197.13 mg/kg FW不等（图 1c）。XLH葡萄果皮中黄烷醇的总浓度明显高于其他葡萄品种。此外，与山-欧杂种葡萄相比，山葡萄果皮中黄烷醇的总浓度较低。就年份而言，2021年葡萄的果皮黄烷醇含量最低。四种基本单体儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表棓儿茶素（ECG）和表儿茶素没食子酸酯（EGC）以游离单元、末端单元和延伸单元三种形式被检测到。EC是葡萄中最主要的黄烷醇，在不同品种的葡萄中，EC的含量远远高于其他单体（图 2g）。此外，在山-欧杂种葡萄中，EC所占的比例要高于山葡萄，在XLH中高达96.15%。与其他葡萄品种相比，SF中的EC比例相对较低，占 64.39%。其次是C和EGC，它们在SF中的比例比其他葡萄品种高（分别为15.43%和19.41%），在XLH中最低，ECG只占黄烷醇的一小部分。黄烷醇在葡萄皮中主要以延伸单元的形式存在，尤其是在XLH中浓度最高。就游离单元和末端单元而言，BBH 的浓度高于其他葡萄品种。

  种子黄烷醇的总浓度在不同年份之间差异很大，从1636.43到17054.66 mg/kg FW不等（图 1d）。与果皮黄烷醇相比，葡萄种子黄烷醇的总浓度要高得多，其中山葡萄的含量低于山-欧杂种葡萄。2021年的种子总浓度低于其他两年，这与葡萄皮中黄烷醇的结果一致。从种子黄烷醇的组成来看，EC的比例占绝对优势，在所有葡萄品种中的比例超过 96%，而其他单体只占很小的比例（图 2h）。葡萄种子中的黄烷醇也主要以延伸单元的形式存在，此外，XLH的游离单元浓度高于其他品种，而延伸单元和末端单元则没有显示出一致的规律。

  2.4 山葡萄和山-欧杂交葡萄的类黄酮特征

  为了进一步分析不同葡萄品种的类黄酮化合物特征，采用PLS-DA对不同年份和地区的葡萄品种进行了分析（图 3a，b）。模型 R2 (X) = 0.94，R2 (Y) = 0.821，Q2 = 0.721 > 0.5，表明模型具有很高的稳定性和预测能力。该模型能将BBH和 XLH与其他葡萄品种区分开来，说明BBH和XLH有其独特的类黄酮特征，而其他品种的类黄酮特征相对相似。结合载荷图，山葡萄和ZYH含有更多的非酰化花青素双糖苷。BBH的特征是酰化花色苷、C-skin、EGC-skin和ECG-seed，而XLH 含有更多的黄酮醇和其他黄烷醇。

  由于PLS-DA并不能区分山葡萄品种，因此采用O2PLS-DA研究不同葡萄品种的类黄酮特征。如图 3c、d 所示，通过O2PLS-DA可以很好地区分不同的 山葡萄品种。R2Y在0.8以上，Q2在0.7以上，说明O2PLS-DA模型的拟合和预测能力可以接受，没有发现过拟合现象，表明所筛选的特征化合物具有很强的说服力。SY位于第1象限，富含二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、Sy和La衍生物。BGH含有更多的黄酮醇，如Ka-衍生物、杨梅酮-3-O-葡萄糖醛酸和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸。BGL位于X轴负半轴，其特点是EGC-skin和花色苷含量较高，尤其是花青素双糖苷（除了二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷）。与其他葡萄品种相比，SH的甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和ECG-seed含量更高。此外，甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3,5-O-二葡萄糖苷和ECG-seed的含量也较高。值得注意的是，通过O2PLS-DA 测定的类黄酮化合物含量只在山葡萄的范围内，并不包括山-欧杂种葡萄。

  2.5 不同地区的特征类黄酮化合物以及环境对类黄酮的影响

  为了探究两个不同地区的生物标志物，采用OPLS-DA分析了三个年份的类黄酮物质。如图4a、b所示，OPLS-DA 结果表明，左家葡萄和集安葡萄可以很好地区分。经测试，该模型具有很高的稳定性和预测性，没有出现过拟合现象。结果表明，左家葡萄含有较多的黄酮醇和黄烷醇，而集安葡萄则富含花色苷。值得一提的是，集安葡萄中西伯利亚落叶松黄酮-3-O-葡萄糖苷和丁香亭-3-O-葡萄糖苷的含量较高，这与大多数类黄酮化合物的变化规律不同。经OPLS-DA模型筛选，有15种类黄酮化合物的VIP值大于1.0且在不同葡萄品种和年份中一致出现，被确定为标记化合物，其标签如图4b所示。我们发现大多数化合物都是黄酮醇，这表明黄酮醇是区分不同地区葡萄的主要化合物。

  为探究气候和土壤因素对类黄酮化合物的影响，进行了相关性分析，如图5 所示。为了克服栽培品种之间的差异，进行了归一化处理。除Sy-和La-衍生物外，大多数黄酮醇与气候因子（包括T平均值（平均温度）、GDD和降雨量）呈负相关，但与日照时数和大多数土壤养分指标呈正相关。由于集安土壤中全钾含量较高，因此与其他土壤因子不同，它们与左家富含的黄烷醇呈负相关。果皮黄烷醇和种子黄烷醇的变化规律与黄酮醇大致相同，只是略有差异，但没有显著的相关性。总花色苷和大多数类型的花色苷的趋势与黄酮醇和黄烷醇相反，与气温和降水呈正相关，而与大多数土壤因子呈负相关。然而，花翠素衍生物和乙酰化花色苷的结果与大多数花色苷相反，它们与日照时间和大多数土壤养分指标呈正相关，与大多数黄烷醇一致。黄酮醇与气象和土壤因子有明显的相关性，表明黄酮醇受环境因子的影响很大。

  3 结论

  本研究对来自左家和集安的8个山葡萄品种及其与欧亚种葡萄的杂交品种的类黄酮化合物进行了连续三个年份的检测。结果表明，与山-欧杂种葡萄相比，山葡萄的花色苷含量更高，但黄烷醇含量较低。山葡萄和山-欧杂种葡萄的花色苷以单糖苷和双糖苷两种形式存在，但山葡萄不含酰化花色苷。PLS-DA和 O2PLS-DA表明，8个葡萄品种之间存在显著差异，并确定了不同栽培品种的生物标志物。山葡萄的特点是非酰化花青素双糖苷含量较高。BBH含有丰富的酰化花色苷、果皮儿茶素、果皮表儿茶素没食子酸酯和种子表棓儿茶素，而XLH 含有更多的黄酮醇和其他黄烷醇。从地区来看，左家葡萄含有更多的黄酮醇和黄烷醇，而集安葡萄的花色苷含量更高。在类黄酮化合物中，黄酮醇是本研究中受气候和土壤因素影响最大的化合物。我们的研究报告了不同山葡萄品种的类黄酮谱，揭示了气候和土壤对其的影响，为山葡萄的进一步探索和应用提供了宝贵的见解，并有助于野生葡萄栽培品种的开发。