质量安全与营养品质评价岗
赵慧宇 齐沛沛 王新全等
挥发性香气成分在葡萄风味中占据着重要位置，主要包括酸类、醇类、酯类、萜烯类、醛酮类和酚类等几大类。这些物质的种类、含量、感官阈值及其之间的相互作用，均会对葡萄的口感产生影响，同时，也会直接关系到葡萄的品质特征。不同葡萄品种，甚至同一品种的不同产地，其风味成分也有着着明显的差异。国内对葡萄中风味物质的研究主要集中在对葡萄果实的品质评价，本研究通过采用固相微萃取（SPME）技术富集葡萄中挥发性风味化合物，结合高分辨率气相色谱-四极杆-飞行时间质谱（GC-Q-TOF），应用内标法进行定性定量分析，通过OAV 鉴定出了多种关键风味化合物，研究结果对今后葡萄品种选育工作、品种鉴定或溯源等工作提供了关键的方法依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料与试剂
实验材料：本研究采集了57个品种，其中48种鲜食葡萄，9种酿酒葡萄（见表1和表2）。鲜食葡萄均采自浙江省农科院杨渡种植基地种质资源库；酿酒葡萄采自宁夏九个不同生产基地。所采样品匀浆后混合制备成均一的样品供方法开发使用，样品经液氮快速冷冻后储存于-80℃冰箱中备用。
实验试剂：氯化钠（分析纯）：广东光华科技股份有限公司； 2-甲基-3-庚酮（色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇（色谱纯）：默克股份两合公司；丙酮（分析纯）：永华化学股份有限公司；蒸馏水：中国杭州娃哈哈集团。
1.2 主要仪器与设备
L3-C1 榨汁搅拌机：中国九阳股份有限公司；BSA2202S 电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Agilent 7890B-7250 GC-Q-TOF 检测器，DB-5MS 10弹性石英毛细管柱：美国 Agilent 公司。
1.3 SPME 固相微萃取法
萃取方法：取适量各样品分别用搅拌机制成匀浆，置于-80℃保存，用于实际样品风味物质分析；每个样品各取等量匀浆混合制成混样，置于-80℃保存，用于SPME 方法优化。称取 2.00 g 匀浆于 20 mL 顶空瓶（75.5×22.5 mm）中，初始条件为加入2.0 mL 饱和食盐水溶液，后加入 200 μL 2-甲基-3-庚酮（10 ppm，丙酮为溶剂）作为内标物。每个样本做三组平行分析。
进样方法：优化前方法，萃取前先在安捷伦 7890B 气相色谱系统上预处理 60min，注射器温度保持在 250℃。将装有样品的螺旋顶空瓶以 30℃振荡。纤维进入顶空的深度为 2 cm。进行 40min 顶空萃取后移除 SPME 萃取头，并将样品瓶直接引入GC-Q-TOF-MS 系统进行解吸和分析。解吸时间为 5 min。
方法优化：本研究采用单因素实验探究盐离子效应（n（NaCl）=0 mol/L、1.35mol/L、2.7 mol/L、4.05 mol/L、5.4 mol/L）、萃取温度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）、萃取时间（10 min、20 min、30 min、40 min、60 min）、平衡时间（5 min、15 min、30 min）各因素对 SPME 固相微萃取效果的影响，在初始方法条件下依次改变上述因素，综合考虑萃取的总化合物数量、总化合物浓度、关键化合物数量和关键化合物浓度等参数指标，并进行有效性验证，从而实现SPME-GC-Q-TOF方法的开发。
1.4 GC-Q-TOF 定性及定量方法
仪器情况：采用安捷伦7890B-7250 GC/Q-TOF-MS检测器，该检测器配备了由 Gerstel软件控制，允许自动进样。
色谱条件：DB-5MS 10弹性石英毛细管柱，以氦气（纯度≥ 99.999%）作为载气，流速为 1.0 mL/min；柱箱程序升温条件：起始温度40℃，保持2min，再以5℃/min升温到280℃，保持10 min；溶剂延迟3分钟，以保护离子源灯丝免受损伤。
质谱条件：离子源：EI；电子能量：70eV；离子源温度：250℃，接口温度：250℃；四级杆温度：250℃；质量扫描范围：全扫描模式，质量范围 33-500m/z；采集速率：4.00 质谱图/秒；采集时间：250 毫秒/质谱图，6min~61min。
定性分析：将各化合物的质谱图与 NIST 17 标准谱库中的质谱图进行比对，满足匹配因子大于等于75；计算各化合物的保留指数（RI），满足与标准谱库保留指数差值绝对值小于等于30。
定量分析：采用内标法进行相对定量，假设相对校正因子为1，组分x浓度依据式（1）计算，式中A（x）和A（i）分别为待测物和内标物的峰面积，C（x）和C（i）分别为待测物和内标物的浓度。
1.5 关键化合物判别方法
将化合物OAV值作为关键风味化合物的判别依据，OAV≥1的化合物判断为关键性风味化合物，OAV值采用式（2.2）计算出待测化合物浓度后通过计算获得，其中感觉阈值采用化合物在水中嗅觉阈值（OTs）。通过分析OAV值，可以对影响样品味道的化合物进行重要性评估。通常情况下,OAV 较高的化合物对样本的风味影响更为显著。一般而言，OAV 达到或超过1的化合物被视为对味道有显著贡献的关键成分，而OAV 低于1的化合物则被认为是对味道影响较小的成分。
2 方法优化
2.1 盐效应
盐效应是影响萃取效果的一个重要因素，盐离子浓度的提高可以增强体系的离子强度，使葡萄中的易溶性风味化合物在体系中溶解度降低，使之更容易被涂层吸附萃取，但当盐浓度过大时，又会因为静电相互作用使大分子物质聚合而让图层吸附萃取率下降，本研究利用 NaCl不同浓度溶液对萃取效果的影响进行盐效应的条件优化。
本研究中使用的不同浓度NaCl溶液浓度水平通过饱和NaCl溶液和水的不同体积比配制，分别是0 mol/L（饱和NaCl溶液与水的体积比为0:4，下同）、1.35 mol/L(1:3)、2.7 mol/L(2:2)、4.05 mol/L(3:1)、5.4 mol/L(4:0)。五种浓度水平下 NaCl 溶液对萃取效果的影响如下图（图 1），随着NaCl溶液质量分数的增加，萃取的总化合物浓度和关键化合物浓度呈现先增加后减少再增加的趋势，萃取的总化合物数量和关键化合物数量则呈现先增加后减少的趋势。NaCl溶液浓度为1.35mol/L时萃取的化合物浓度和数量综合表现较好。因此，后续实验将采用浓度为1.35mol/L的NaCl溶液进行萃取。
2.2萃取温度
萃取温度可以影响分析物的吸附和解吸速率，进而影响萃取效果。随着萃取温度的缓慢升高，萃取效率呈缓慢上升趋势，这是因为萃取温度升高，分析物在样品体系中的扩散系数增大，导致吸附速率加快；萃取温度继续升高，分析物分配系数减小，容易从涂层上脱附，导致解吸速率加快。本研究在以下条件下进行萃取温度的优化：30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和 70 ℃。不同因素水平下萃取温度对萃取效果的影响如下图（图 2）。随着萃取温度逐级攀升，萃取的总化合物浓度未见显著波动，而萃取的总化合物数量基本呈现先上升后持平的趋势，这可能是因为萃取温度对分析物扩散系数和分配系数的影响。综上，后续实验将采用 50 ℃作为萃取温度进行吸附萃取。
2.3 萃取时间
萃取时间受目标分析物在吸附涂层和样品体系之间分配速率的影响。当目标分析物在两者之间达到平衡状态时，意味着萃取吸附量已达到最大值。然而，因为不同化合物的分配系数有所区别，它们被涂层吸附的速度各不一样，所以达到平衡状态所需的时间也就不同。萃取时间过短则大部分化合物吸附量较少，萃取时间过长则会引起明显的吸附位点竞争。本研究在以下条件下进行萃取时间的优化：10 min、20 min、30 min、40 min 和 60 min。不同条件下萃取时间对萃取效果的影响如下图（图 3）。随着萃取时间增加，总化合物数量呈现先轻微下降随后上升最后平稳的趋势，而总化合物浓度则呈现先上升后趋于稳定的趋势。当萃取时间延长至60分钟时，尽管化合物总量变动不大，但40分钟时的浓度更高，表明在40min的条件下大部分化合物一件获得了较为充分的吸附量。因此，决定在后续实验中，将萃取时间设定为40 min，这样可以在确保化合物萃取效果的基础上，同时考虑到操作的效率。
2.4 解吸时间
通常情况下，解吸时间越长，解吸效果越好，但由于温度等影响，解吸时间过长可能导致样品中部分化合物挥发或分解导致解吸附效果变低，本研究对解吸时间的优化条件如下：5min、15min、30min。不同解吸时间对萃取效果的影响如下图（图 4）。随着解吸时间的增加，萃取的总化合物数量和浓度均呈现先上升后下降的趋势。因此，后续实验将采用 15min 作为解吸时间进行萃取。
采用优化后的SPME-QC-Q-TOF 方法对表2.1 中的48 种葡萄样本进行定性定量分析，除去葡萄中不含有的烷烃类及其他农药成分，共鉴定出相关风味化合物108 种，其中包括酯类28 种、萜烯类23 种、醇类9 种、醛酮类18 种、酸类3 种、酚类5 种，其总化合物种类数和浓度对比图如图5。葡萄样品中酯类数量最多，其次是萜烯类、醛酮类、醇类，而平均浓度最高的是醛酮类，其次是醇类。
通过OAV≥1 初步鉴定出30 种关键风味化合物，包括酯类5 种、醛酮类11种、醇类9 种、萜烯类1 种、酸类1 种、酚类1 种,其他类2 种。如表3。
3 结论
本研究主要以不同品种葡萄为研究对象，采用单因素实验优化了SPME-GC-Q-TOF 对葡萄的挥发性风味物质分析方法，可以对葡萄中的挥发性成分进行快速、高灵敏度的分析，提高了分析的准确性和可靠性。通过优化后方法，本研究对不同葡萄品种的特征风味物质进行了深入挖掘和分析，在葡萄样品中共鉴定出 108 种相关风味化合物，包括酯类28种、萜烯类23种、醇类9种、醛酮类18种、酸类3种、酚类5种。其中酯类数量最多，其次是萜烯类、醛酮类、醇类，而平均浓度最高的是醛酮类，其次是醇类、萜烯类和酯类。
通过OAV≥1鉴定出30种关键风味化合物，包括酯类5种、醛酮类11种、醇类9种、萜烯类1种、酸类1种、酚类1种、其它2种。通过对关键性风味化合物的气味特征，分析得出各品种香气成分组成，建立了基于风味物质的葡萄品种分类模型，为葡萄品质评价和品种鉴别提供了科学依据。