育种方法与技术岗位

  葡萄稳定遗传转化困难，需要大量的时间进行愈伤组织的诱导、分化和继代，周期较长，技术要求严。因此，本方法以葡萄组培苗为材料，利用发根农杆菌介导建立一种快速、便捷的根转化体系，为今后开展葡萄特定的基因功能研究和遗传改良奠定基础。

  1、试验材料与试剂。

  挑选生长健壮且生长势较为一致的无核白组培苗为试验材料；试验中使用到的发根农杆菌为MSU440，植物载体为pNMG-GFP；试验中所用的药品包括： MES、MgCl2、乙酰丁香酮、LB培养基、卡纳霉素、链霉素、DMSO等。

  2、实验步骤。

  （1）组培苗准备：根据组培苗的生长情况截短组培苗，截短后每个茎段至少保留一个叶片及一个芽眼（图a-b）。

  （2）农杆菌活化及收集：将pnmg-gfp载体通过化学转化法至MSU440发根农杆菌，并涂板于50mg·L-1 Kan，50 mg L-1 Stre的LB固体培养基。挑取单克隆用含有相同抗生素的LB液体培养基摇菌OD600至0.8，5000 rmp 10 min 收集菌液并使用MES缓冲液（10 mM MES，10 mM MgCl2，100 μM乙酰丁香酮）调整OD600至0.5-0.6，室温静止2 h。

  （3）茎段浸泡侵染：将茎段下端至于菌液中浸泡10-15 min，浸泡期间轻微晃动，保证茎段下端的菌液接触（图c）。

  （4）植株培养：将完成浸泡的植株直接扦插至土壤中并放置于25℃组培室（16 h光照/8 h黑暗）培养（图d），培养阶段注意植株保湿（前期需盖培养盖）。

  （5）根部观察：茎段扦插后下端会逐步发根，由于载体带有GFP蛋白，可使用488 nm光源观察植株根部GFP发光情况，若转基因植株根在488 nm波长光源下散发绿色荧光，表明发根农杆菌可介导葡萄下胚轴形成转基因毛状根（图e-i）。