豫东综合试验站

娄玉穗 吕中伟 尚泓泉 崔小月 张柯 樊红杰 吴文莹

  葡萄果锈是果实遭受不良环境刺激产生的一种生理性病害，表现为果实表面呈现条状或不规则状黄褐色锈斑，严重时连成片，致使果实表皮形成木栓化组织，严重影响其外观品质和经济价值，该病在黄绿色葡萄品种上尤为凸显，尤其是在近年来我国大面积种植的阳光玫瑰葡萄品种上，成为降低其商品性的重要原因。果锈是一层褐色的木栓化次生保护组织，果锈的形成主要是果皮角质的减少和木质素、木栓质的积累，木质素、酚类、芪类、木栓质等物质含量的变化与果锈的形成密切相关。本研究中以无果锈、轻度果锈（果锈刚发生）和严重果锈（果锈发生后期）的阳光玫瑰葡萄果粒为对象，分析比较其果皮物质、相关酶活性及代谢组的变化，以期找出影响葡萄果锈形成的关键代谢物和生物过程，为探明葡萄果锈形成的机制奠定基础，也为果锈有效防治技术开发提供科学的指导建议。

  1.材料与方法

  1.1 试验材料

  以6年生阳光玫瑰葡萄植株为试材，自根砧，南北行向，株行距1.5 m × 3 m，高宽平架式，简易避雨栽培。于见花时修整花穗，留穗尖6 cm，盛花后1~3 d（5月11日—13日）和2周后用25 mg·L-1 赤霉酸+ 2 mg/L·L-1氯吡脲进行保果和膨大处理。在果粒黄豆粒大小时疏果至60粒左右，控制单穗质量700 g左右。

  1.2 样品采集

  在果实成熟期（8月21日），采集无果锈和有果锈的果粒样品，按照果锈发生程度分成无果锈（NR，No Russet）、轻度果锈（MR，Mild Russet，果锈面积＜10%且果锈颜色浅）和重度果锈（SR，Severe Russet，果锈面积≥25%且果锈颜色深）三组（图1）。先用刀片划出取样部位（无果锈样品划出表皮光滑、无斑点部位，轻度果锈和重度果锈样品划出有果锈部位），然后用镊子分别夹取三组果皮样品，置于液氮中快速冷冻，带回实验室用于果皮广泛靶向代谢组检测。

  1.3 果皮广泛靶向代谢组检测

  将样品置于冻干机中真空冷冻干燥，研磨仪研磨（30 Hz，1.5min）至粉末状，用电子天平称取50 mg粉末，加入1200 μL-20 ℃预冷的70%甲醇水内标提取液中，每30 min涡旋一次，每次持续30 s，共涡旋6次；然后在12 000 r·min-1下离心3 min，取上清，用微孔滤膜（0.22 µm）过滤样品，保存于进样瓶中用于超效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS）分析。

  1.4 代谢物定性与定量分析

  代谢物的定性基于武汉迈维生物技术有限公司自建数据库（MWDB）及代谢物信息公共数据库，根据二级谱信息进行物质定性，分析去除了同位素信号和重复信号。代谢物定量分析利用三重四级杆质谱的多反应监测模式（MRM）分析完成。利用软件Analyst 1.6.3处理质谱数据。根据代谢物保留时间与峰型信息，对每个代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。

  1.5 数据分析

  将代谢物数据进行无监督的主成分分析（PCA）和有监督的正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）以观察分组之间和组内样本之间的变异度大小。根据获得的多变量分析OPLS-DA模型的变量重要性投影VIP值（VIP＞1）和差异倍数值（Fold Change≥2和fold change≤0.5，FC）筛选差异代谢物。将差异代谢物映射到KEGG数据库和Metware database中进行注释，根据注释结果按照通路中的类型进行分类。

  2.结果与分析

  2.1 不同果锈程度的阳光玫瑰葡萄果皮代谢组成分总体分析

  不同果锈程度的阳光玫瑰葡萄果皮经UPLC-MS/MS分析，共鉴定出1372种代谢物，按照物质一级分类属于13类、二级分类属于52类，包括270种黄酮、223种萜类、188种其它类、163种酚酸类、127种氨基酸及其衍生物、115种脂质、106种生物碱、53种木脂素和香豆素、37种有机酸、36种核苷酸及其衍生物、29种鞣质、15种醌类、10种甾体。其中，与无果锈相比，轻度果锈上调代谢物有690种，下调代谢物有682种；与轻度果锈相比，重度果锈上调代谢物有920种，下调代谢物有452种；与无果锈相比，重度果锈上调代谢物有835种，下调代谢物有537种。

  2.2 主成分分析

  通过对样本进行主成分分析，初步了解不同果锈程度阳光玫瑰葡萄果皮的总体代谢组差异和组内样本之间的变异度大小。PCA分析结果得到13个主成分，其中主成分1（PC1）的贡献率为41.20%，主成分2（PC2）的贡献率为18.84%，且三组样本在二维图上表现出明显的分离趋势，从总体上反映出三组样品之间的代谢物差异。

  2.3 差异代谢物筛选

  不同程度果锈的阳光玫瑰葡萄果皮差异代谢物有485种，其中，轻度果锈与无果锈果皮间显著差异的代谢物有247种，显著下调代谢物有65种，显著上调代谢物有182种；重度果锈与轻度果锈果皮间显著差异的代谢物有287种，显著下调代谢物有31种，显著上调代谢物有256种；重度果锈与无果锈果皮间显著差异的代谢物有386种，显著下调代谢物有65种，显著上调代谢物有321种（表4）。对三组差异代谢物进行韦恩图分析，发现三组中共有的差异代谢物有110种（图3）。

  2.4 差异代谢物热图分析

  对三组中共有的110种差异代谢物进行热图分析，发现有105种差异代谢物在三组中均表达上调，占所有差异代谢物的95.45%，包括37种酚酸类、31种黄酮（1种异黄酮、2种其它类黄酮、1种黄烷醇类、19种黄酮醇、4种黄酮、2种花青素、2种二氢黄酮）、22种其它类（包括17种茋类、1种色酮类和4种其它）、5种醌类（2种醌类、3种菲醌）、3种萜类（2种三萜皂苷、1种倍萜）、3种氨基酸及其衍生物、2种木脂素和香豆素（木脂素）、1种生物碱和1种鞣质（原花青素）；2种在三组中均表达下调，包括1种脂质（4-羟基鞘氨醇）和1种核苷酸及其衍生物（N6-异戊烯腺嘌呤）；3种黄酮类物质（1种黄酮、1种查耳酮、1种黄酮醇）在MR与NR中表达下调，在SR与MR和SR与NR中均表达上调。

  2.5 差异代谢物通路分析

  通过KEGG数据库和MetMap数据库对差异代谢物质进行通路富集分析，结果以气泡图的形式展现，气泡代表代谢通路，气泡所在横坐标和气泡大小表示影响值，气泡越大，表示通路越重要；纵坐标和气泡颜色表示富集分析的P值，颜色越深P值越小，富集程度越显著。由图4可知，上述110种差异代谢物质中有17种被注释到17条代谢途径中，其中，被注释到山柰酚苷元II的生物合成有6种，被注释到山柰酚苷元I的生物合成和次生代谢物的生物合成有4种，被注释到代谢途径有3种，被注释到槲皮素苷元 I的生物合成、二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚的生物合成和酪氨酸代谢有2种，被注释到花青素的生物合成、槲皮素苷元II的生物合成、槲皮素苷元III的生物合成、黄酮和黄酮醇的生物合成、糖酵解/糖异生、泛醌和其他萜类醌的生物合成、辅因子的生物合成、鞘脂代谢、玉米素的生物合成、植物激素信号转导有1种。说明阳光玫瑰葡萄果锈发生对山柰酚苷元II的生物合成的影响最显著。

  2.6 山柰酚苷元II的生物合成途径分析

  在山柰酚苷元II的生物合成途径中，被注释到的6种差异代谢物均属于黄酮类，其中，6-羟基山柰酚-3,7,6-O-三葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-7,6-O-二葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3,6-O-二葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3,6-O-二葡萄糖苷-7-O-葡萄糖醛酸和6-甲氧基山柰酚-3-O-葡萄糖苷在三组中表达均上调，而山柰酚-4'-O-葡萄糖苷在MR与NR中表现下调，在SR与MR和SR与NR中均表达上调。

  3. 讨论与结论

  果锈是果实发育过程中的一种生理紊乱现象，黄绿色的葡萄、苹果、梨等更容易发生果锈，如阳光玫瑰葡萄、金冠苹果、翠冠梨等，成为降低其商品性的重要原因。生产上常用套袋、植物生长调节剂处理、施钙肥等方法来降低果锈的发生，而这些方法只能在一定程度上起作用，不能完全解决，究其原因是还没有完全掌握果锈的发生机制。

  果锈的形成是一个复杂的生物过程，主要涉及到木栓质在果皮中的积累，木质素和脂肪酸代谢是两个重要的代谢途径，其为木栓质及其他物质合成提供前体物质。代谢组学是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的一门学科，为研究生物代谢物及生物过程提供了很好的方法。本研究中，在无果锈、轻度果锈和重度果锈的阳光玫瑰葡萄果皮代谢组的两两比较中，发现有110种共有差异代谢物，其中，有105种随着果锈发生程度的增加而表达上调，2种表达下调，这105种表达上调的代谢物中有37种酚酸、31种黄酮、17种茋类、5种醌类、3种萜类等，表达下调的2种代谢物为1种脂质（4-羟基鞘氨醇）和1种核苷酸及其衍生物（N6-异戊烯腺嘌呤），说明在阳光玫瑰葡萄果锈发生过程中，酚酸、黄酮、茋类等物质在果皮中积累，而脂质和核苷酸及其衍生物在果皮中减少。Huang等（2020）在阳光玫瑰葡萄无锈果皮与有锈果皮中发现有60种差异代谢物，其中，43种表达上调、17种表达下调，表达上调的代谢物中有29种酚类物质，包括10种槲皮素相关糖苷，本研究也发现有4种槲皮素相关糖苷在有果锈果皮中表达上调。在葡萄中，芪类物质的生物合成途径受非生物胁迫响应，且芪合酶位于果皮细胞壁上，Suehiro等（2014）的研究表明，阳光玫瑰葡萄芪合酶基因VvSTS type B的表达上调与果锈形成相关。

  通过对差异代谢物的功能注释及富集分析有助于了解特定条件下的生物代谢途径。本研究中，通过对110种共有差异代谢物进行注释分析，发现有17种差异代谢物质被注释到17条代谢途径中，其中，被注释到差异代谢物较多的代谢途径有山柰酚苷元II的生物合成、山柰酚苷元I的生物合成、次生代谢物的生物合成、代谢途径、槲皮素苷元 I的生物合成、二苯乙烯、二芳基庚烷和姜酚的生物合成、酪氨酸代谢等。在山柰酚苷元II的生物合成途径中，6种差异代谢物均属于黄酮类物质，其中，6-羟基山柰酚-3,7,6-O-三葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-7,6-O-二葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3,6-O-二葡萄糖苷、6-羟基山柰酚-3,6-O-二葡萄糖苷-7-O-葡萄糖醛酸和6-甲氧基山柰酚-3-O-葡萄糖苷随着果锈程度的增加均表达上调，而山柰酚-4'-O-葡萄糖苷在MR与NR中表现下调，在SR与MR和SR与NR中均表达上调。山柰酚糖苷属于黄酮醇类物质，存在于许多蔬菜、水果及中草药中，具有广泛的药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、保护损伤组织等，因其毒副作用小，越来越受到人们的关注，如香石竹中有山柰酚三糖苷、山柰酚-3-O-新橙皮苷。本研究山柰酚苷元II的生物合成和山柰酚苷元I的生物合成均参与到阳光玫瑰葡萄果锈形成过程中，且多个山柰酚糖苷在果皮中积累，说明山柰酚苷元的生物合成和这几种山柰酚糖苷可能在阳光玫瑰葡萄果锈形成中发挥着重要作用。