福州综合试验站

  葡萄（Vitis spp.）在世界范围内广泛种植，在全球果树构成及产业经济方面具有重要地位。然而葡萄栽培生产过程中的病害威胁影响着产业的进一步发展，如霜霉病、白腐病、灰霉病等，尤其是葡萄炭疽病（grape ripe rot），主要侵染葡萄果实，在转色期至成熟期发病，给葡萄产量和品质带来巨大损失。葡萄炭疽病对我国南方夏季葡萄鲜果生产危害尤为严重，目前对其防治主要依赖大量的农药喷施，但也造成葡萄果实、土壤以及地下水的污染，危害人体健康，长期使用农药还会导致炭疽病菌小种变异，产生抗药性，引起病害的扩大和蔓延。阮仕立等发现刺葡萄作为野生资源，在响应抗炭疽病的侵染过程中具有较强的抗性。因此，利用中国野生葡萄抗病种质资源，挖掘其中的抗炭疽病基因，可为开展抗病育种提供基因资源，利于解决葡萄炭疽病问题。

  生长调节因子（Growth regulatory factors，GRF）是一种植物特异性转录因子，在植物生长发育过程中起着重要作用。已确定的GRF基因家族的第一个成员是OsGRF1，它在赤霉素诱导的茎伸长中起调节作用 ；GRF转录因子在N端区域有两个保守结构域：QLQ（Gln、Leu和Gln）和WRC（Trp、Arg和Cys） ；GRF基因通常在积极生长和发育的组织中强烈表达，如发芽的种子、穗、芽、花蕾和幼叶；拟南芥的 AtGRF1/AtGRF2/AtGRF3三联体突变体通过调节细胞的扩增，促进叶片和子叶的变小，AtGRF5与AtGRF1共同正向调节叶片原基的发育；水稻OsGRF4 通过调控细胞分裂素氧化酶/脱氢酶基因（CKX1和 CKX5）的表达来增加穗长；木薯MeGRF4对低温和盐胁迫有响应；高温胁迫下，草莓FvGRF4和FvGRF9均上调表达。这些研究表明植物GRF转录因子在植物响应非生物胁迫以及在生长发育进程中扮演着重要的角色，而对于其在响应病原菌侵染中未见报道。

  1 材料与方法

  1.1 葡萄GRF基因鉴定与理化特性预测

  从酿酒葡萄基因组数据库（http：//plants. ensembl.org/hmmer/index.html）获取葡萄的全基因组文件以及植物转录因子数据库（http：//planttfdb. gao-lab.org）下载GRF基因信息。基于GRF家族成员的蛋白结构域，使用 HMMER3.1 软件（http：//hmmer.org）鉴定葡萄GRF家族基因。利用ProtParam在线网站（https：//web.expasy.org/ protparam）分析GRF基因家族成员的蛋白特性，包括相对分子量、等电点（PI）等。

  1.2 葡萄GRF蛋白保守基序分析

  使用MEME 5.3.0工具（http：//meme-suite.org/ tools/meme）在线分析GRF蛋白的保守基序，保守位点的宽度设置为10~100个氨基酸，保守基序鉴定数目设置为10个。

  1.3 葡萄GRF基因家族系统发育树构建

  从TAIR数据库网站（https：//www.arabidopsis. org）下载拟南芥GRF基因家族蛋白序列文件。采用ClustalW对比拟南芥GRF和葡萄GRF家族蛋白的序列，将对比结果输入MEGA7.0软件（https： //www.megasoftware.net），采用邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树，bootstrap值为1 000。

  1.4 葡萄GRF基因家族启动子顺式元件分析

  从葡萄基因组文件中提取GRF家族基因起始密码子上游2000 bp作为启动子区域，使用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html）进行启动子顺式元件分析。 采用TBtools软件绘制葡萄GRF启动子区域不同顺式作用元件的数量图。

  1.5 葡萄GRF基因表达分析

  供试材料为刺葡萄，采自福建宁德福安，以成熟果粒未接种炭疽病菌为对照（CK），并以成熟果粒离体接种炭疽病菌处理的1、2、4、6 d 收集果粒样本进行转录组测序。提取接种后不同时间的果实样本总RNA，反转录为cDNA，连接adaptor，最后利用 Illumina进行测序。测序完成后，使用RSEM软件分析接种后不同时间的果粒样本GRF 表达量及表达差异，绘制差异基因表达热图。

  2 结果与分析

  2.1 葡萄GRF基因鉴定与理化特性分析

  利用转录因子数据库（http：//planttfdb.gao- lab.org）及HMMER3.3.2（ http：//hmmer.org）软件共鉴定获得8个葡萄GRF家族基因，并命名为VvGRF1L、VvGRF1-7（表 1）。GRF基因编码序列长度为639~1812 bp，分子量23.32~63.70 KD，编码213~604 个氨基酸，等电点6.25~9.36，预测基因分别定位于第18、11、9、2、16、8、16条染色体上。

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  2.2 葡萄GRF的系统进化分析

  为探究葡萄GRF家族成员之间的发育关系， 将葡萄和拟南芥的8个GRF蛋白序列进行比对，并构建系统发育树（图 1）。结果表明，这些蛋白被分为5组（I-V） ，拟南芥和葡萄的GRF成员在各组均有分布。其中3个葡萄GRF蛋白聚在第V组， 2 个聚在第Ⅳ组，其余每个组均有一个葡萄GRF蛋白。进一步分析发现，大部分的葡萄GRF 成员与拟南芥家族同源性都较高，说明植物的GRF在进化上具有较高保守的结构。

  2.3 葡萄GRF基因家族保守基序分析

  通过MEME在线工具，鉴定到葡萄GRF蛋白序列中出现10个保守基序Motif1-10）。结果如图2所示，除了VvGRF3不含Motif4外，其余的葡萄GRF家族成员均含有Motif1、Motif2和Motif4，说明葡萄GRF家族的成员具有相似的基序类型。进一步发现，所有成员在N端是高度保守的，而在C端是不保守的。利用Pfam网站对Motif1和Motif2进行注释，发现Motif1属于WRC结构域，Motif2属于QLQ结构域。以上结果表明，C端的不保守可能导致了不同GRF成员间的功能分化。02

  2.4 葡萄GRF基因启动子顺式元件分析

  使用PlantCARE网站分析葡萄GRF基因的启动子序列，鉴定到多种参与激素、胁迫响应以及生长发育相关的顺式作用元件（图3）。其中响应生物与非生物胁迫相关作用元件数量最多，参与激素响应相关作用元件次之，生长发育相关作用元件最少。不同基因含有不同类型的作用元件， 如VvGRF2含有10个响应脱落酸以及9个光响应相关作用元件，且其顺式元件最多达到52个；VvGRF4含有7个干旱胁迫以及4个响应脱落酸等相关作用元件，并且含有多个与病原菌响应相关的水杨酸和茉莉酸激素元件，说明VvGRF4很可能是响应干旱胁迫及对病原菌的免疫反应。

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  2 5 葡萄GRF基因在响应炭疽病侵染的表达模式分析

  葡萄应答炭疽菌侵染的防御反应在很大程度上受转录水平调节，各种转录因子可能在葡萄抗炭疽病中起着重要调节作用，剖析这些转录因子的功能和作用机制是阐明葡萄抗炭疽病分子机制的重要途径。如图4所示，刺葡萄在接种炭疽病菌后，VvGRF7在接种炭疽病的早期（1d）表达水平相比于CK有稍微上升但是不明显，VvGRF4在炭疽病菌侵染后初期具有较高表达，其表达倍数是CK的近4倍（3.99）。其余GRF家族成员在炭疽病处理后表达水平均无明显变化，这可能由于GRF转录因子主要功能与植物生长发育有关，在响应炭疽病病原菌侵染过程中表现不明显。

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  3 讨论

  GRF家族转录因子通过控制细胞分裂参与调控植物生长发育过程中的各种生命过程。研究表明在模式植物拟南芥、水稻、番茄中GRF基因家族成员数目分别为9个、12个和13个。在本研究中共鉴定到8个GRF家族成员，系统发育树分析表明葡萄大部分的GRF成员与拟南芥家族同源性都较高，说明植物的GRF在进化上具有较高保守的结构，为研究GRF基因家族在植物中的功能奠定基础，并为今后GRF基因家族的比较和功能基因组研究提供生物信息学信息和功能参考。

  已有研究报道GRF蛋白具有两个保守基序：QLQ和WRC。本研究在葡萄GRF所有成员的C端均含有QLQ结构域和WRC结构域，以及大部分成员的N端含有Rmic结构域，即QLQ参与蛋白-蛋白相互作用，WRC可调控DNA结合C端的转录，这些结果表明葡萄GRF蛋白在植物中具有进化保守性。

  GRF是植物生长发育的关键调控因子，并应答非生物胁迫逆境，而对于其在响应病原菌的防御反应中鲜有报道。顺式作用元件参与基因表达的调控，与基因功能密切相关。通过对葡萄GRF顺式作用元件分析表明，GRF成员可以在干旱、病原菌等不同胁迫下转录表达，并受水杨酸、脱落酸以及茉莉酸或其衍生物刺激信号调控。本研究表明，GRF 基因家族在葡萄接种炭疽菌后几乎不表达，仅有VvGRF4在病原菌处理中期受诱导表达，表明植株受到病原菌胁迫时，可能通过VvGRF4的表达以激活下游防御相关基因或者其他与激素相关或病原菌防御相关基因（比如说R基因等）的表达，使植株在炭疽病胁迫环境下获取更多能量以维持生存和生长，但具体调控机制有待进一步研究。