济南综合试验站

刘利 李勃

 

 氮素是植物生长发育所必需的大量矿质元素之一，参与作物体内氨基酸、蛋白质、激素、核酸、叶绿素、酶、维生素和生物碱等关键有机化合物的组成（Novoa and Loomis, 1981; Krapp, 2015; 张合琼等, 2016）。氮素是植物生长发育所必需的重要营养成分（Novoa and Loomis, 1981; 张合琼等, 2016; Xu et al., 2016），对促进果树的生长、器官的形成、花芽的分化，提高果树产量及果实品质具有重要的作用（彭福田等, 2006; 李洪娜等, 2015）。植物能够吸收利用生长介质中的无机氮 （硝酸盐和铵盐等）和有机氮（尿素和氨基酸等），无机氮是果树从土壤吸收氮素的主要形式（Qian et al., 2015），包括硝态氮和铵态氮。硝态氮是高等植物可直接利用且最易被植物吸收的氮素营养形态，直接影响光合电子传递、糖类运输、蛋白质表达及二级代谢物等合成（Crawford and Glass, 1998）。Mo是NR的活性成分，在硝酸盐还原为亚硝酸盐的过程中起着传递电子的作用。铵态氮是由土壤含氮有机物在微生物的作用下形成的，在好气条件下很容易成为硝态氮。二者皆为水溶性的，铵态氮主要为交换态，而硝态氮则是土壤溶液的主要成分，可被植物吸收利用。

  钼（molybdenum，Mo）是植物正常生长发育所必需的一种微量元素。岩石圈中Mo的含量一般是1.2 mg·kg-1，通常以MoS2、PbMoO4和Fe2（MoO4）3的形式存在（Kaiser et al., 2005）；植物体内Mo的含量一般是0.2 mg·kg-1（Gupta, 1991）。在土壤中，Mo主要以钼酸根离子（MoO42-）的形式存在，参与到各种生命过程中。土壤中有效Mo的含量是评价土壤供Mo能力的指标，Mo的可利用性在高浓度的土壤氮素水平、低温以及低的土壤pH（<5.5）下较低（Nie et al., 2014）。世界上很多地方土壤中的有效Mo含量不能满足植物正常生长发育所需，对于酸性土壤这一现象尤其严重（巫飞飞等, 2015）。据报导，在我国有大约4400多万ha耕地缺Mo（Nie et al., 2014），生长在有效Mo含量低的酸性黄棕壤上的冬小麦等作物出现了严重的缺Mo症状（Yu et al., 2010）。Mo缺乏的症状有钼酶活性降低、氮饥饿反应、茎和叶发育受阻、叶枯斑病、种子发育不良、坐果率降低等（Martin and Meybeck, 1979; Kaiser et al., 2005; 巫飞飞等, 2015）。

  葡萄(Vitis vinifera L.)属于葡萄科葡萄属植物，是我国当前经济栽培效益最好的果树树种之一。2021年我国葡萄的种植面积约为735.50千公顷，产量约1443.00万吨，位居世界葡萄产量的首位。然而，一直以来，我国果树栽培遵循“上山下滩，不与粮棉油争田”的原则，大多数果园主要集中在山地丘陵地区，土层浅，土地瘠薄，立地条件差等问题突出。葡萄种植者为了获取较高的产量和经济效益，过度追求葡萄园早产丰产，滥用化肥（以氮肥为主）。氮肥的过量施用不仅增加了葡萄种植成本，降低了氮素养分响应度和氮肥利用率，而且导致土壤有机质含量低，土壤酸化，矿质营养失衡，威胁我国葡萄产业的健康、持续和稳定性发展。因此，研究钼对不同氮源条件下氮素吸收、利用具有重要的意义。

  1.1 材料与方法

  1.1.1 试验材料与试验设计

  试验于2021年在山东农业科学院济阳基地日光温室进行。葡萄供试品种为3309m嫁接的阳光玫瑰（Vitis labrusca×V. vinifera ‘Shine Muscat’），采用沙培技术，将葡萄幼苗定植于塑料盆中（23 cm × 21.5 cm）。待幼苗长到3~4片真叶时移至栽培槽中进行试验。幼苗用改良的霍格兰营养液进行处理，营养液中含有7.0 µM硝化抑制剂双氰胺，该营养液含N 7.14 mmol/L, N： P：K的比例为 1:0.85:1.1，其它营养元素MgSO4为493 mg L−1 , H3BO3为2.86 mg L−1, Fe-EDTA为30 mg L−1, MnSO4为2.13 mg L−1, ZnSO4·7H2O为0.05 mg L−1, CuSO4·5H2O为 0.05 mg L−1. 不同氮源分别为:硝酸盐（NO3-），硝酸盐和铵盐（NH4NO3，50：50），和铵盐（NH4+），三种氮源下分别添加1 μmol L−1Na2MoO4- ·2H2O 和0 μmol L−1Na2MoO4- ·2H2O作为处理。每个处理50棵幼苗，营养液每7d更换一次，培养50d取样测定各项指标。

  1.1.2 植株生长指标的测定

  植株分为根系和地上部两部分，冲洗干净后，放置烘箱中105°C杀青30分钟，然后80°C烘干，测定干重。

  用清水洗净根系，将根系平铺于透明硬塑料板上，在水中将根系展开，用WinRHIZO (2007年版)根系分析系统获取根系扫描图形，记录总根长、平均根直径、根尖数以及总表面积，重复3次。

  根系活力采用TTC法测定。准确称取0.5g根，洗净，用滤纸吸干，放入盛有10ml等体积0.4% TTC溶液和磷酸缓冲液混合液的试管中，封口，37℃避光培养4h后，加入2ml 1mol/L硫酸终止反应。空白对照先加2 ml 1 mol/L硫酸终止反应。放置15 min后，分别将实验组和对照组的根系取出，滤纸吸干水分，放入研钵中，加入3ml乙酸乙酯，充分研磨，以提取出TTF。把红色提取液(TTF)转移至离心管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2~3次，再将洗涤液一并转移至离心管，补加乙酸乙酯至10ml，封口摇匀，在485nm下比色测定。

  1.1.3 植株钼含量，叶绿素含量，氨基酸和可溶性蛋白含量的测定

  1.1.3.1 植株钼含量的测定

  参照Wang等（2016）的方法进行，称取葡萄干样0.3 g于消解管中，加入5 mL优级纯浓硝酸浸泡过夜后，再加入2 mL优级纯双氧水，采用微波消解萃取仪进行消解，消解完全冷却后转移至比色管中，用超纯水定容至50 mL，放置过夜即可得样品待测液。采用相同消解方法制备空白对照组，用NexION 300X型电感耦合等离子体质谱仪测定。

  1.1.3.2 叶绿素含量的测定

  利用分光光度法（赵世杰等，1998）测定。原理：叶绿体中的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素在不同的溶剂中的吸收光谱有差异。叶绿素a和叶绿素b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰波长分别为663nm和645nm，类胡萝卜素的80%丙酮提取液最大吸收峰波长为470nm，计算公式如下：

  Ca=12.21D663－2.81 D646

  Cb=12.21D663－2.81 D646

  Cx.c=（1000D470－3.27Ca－104Cb）/ 229

  叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的96%乙醇提取液最大吸收峰波长分别为665nm、 649nm和470nm，计算公式如下：

  Ca=13.95D665－6.88D649

  Cb=24.96D649－7.32 D665

  Cx.c=（1000D470－2.05Ca－114.8Cb）/ 245

  取新鲜的样品，清洗干净，剪碎。称取3份0.2g剪碎的叶片分别放入研钵中研成匀浆，研磨时加入少量石英砂和碳酸钙粉及3ml 96% 乙醇，研磨至变白，放置4min左右过滤到25ml棕色容量瓶中，反复冲洗干净，定容摇匀。

  比色测定：96% 乙醇作空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。根据上述公式分别计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度。

  计算公式：叶绿体色素含量=[色素的浓度C*提取液体积*稀释倍数]/样品鲜重

  1.1.3.3 氨基酸含量的测定

  氨基酸浓度采用吸收光谱法测定水合三酮苯胺(Ninhydrin)试剂盒(Comin，苏州，中国)。样品溶液(1ml)在1ml醋酸缓冲液(2mmol L−1,pH 5.4)和1ml茚三酮中研磨，在沸水浴中孵育15min，然后在水中冷却。5分钟后，用3ml 60%乙醇稀释上述混合物。用光谱仪在570nm处测定吸光度。

  1.1.3.4 可溶性蛋白质含量的测定——考马斯亮蓝法

  考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。

    

  试剂:

  （1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg/mL的原液。

  （2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W/V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置1个月。

  （3）乙醇；

  （4）磷酸（85％）。

  样品提取液中蛋白质浓度的测定:

  （1）待测样品制备：称取样品2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。

  （2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL，放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。

  结果计算:

  样品蛋白质含量（mg∕g鲜重）=（C×V/a）/W

  式中：C为查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg）；V为提取液总体积（ml）；

  A为测定所取提取液体积（ml）；W为取样量（g）。

  1.1.4 全N含量、NO3-和NH4+含量的测定

  植株全氮用凯氏定氮法测定（鲍士旦, 2000）。

  采用特制试剂盒(Comin, Suzhou, China)测定茎部和根部样品中的NO3-浓度。将植物样品(1 g)转移到10 mL试管中，加入约5 mL的水，然后在沸水浴中孵育30分钟。匀浆冷却后12000 g离心20 min，将上清移入管中，采用水杨酸法测定NO3-含量。

  根据制造商指南(Comin, Suzhou, China)使用特定试剂盒测定茎部和根部样品中的NH4+浓度。反应液为滤液0.1 mL, 10%酒石酸钾钠0.01 mL，再蒸馏水2.4 mL，奈斯勒试剂0.1 mL。用分光光度计测定5min后在425 nm处的吸光度。

  1.1.5 植株解析样品测定方法

  将植株分成根部、茎部和叶片3部分，放入烘箱中于105℃杀青30 min，80℃烘干至恒重，称重，研磨粉碎后过0.25 mm筛，装袋备用。植株全氮用凯氏定氮法测定（鲍士旦, 2000）。15N丰度在中国农业科学院原子能利用研究所用MAT-251质谱仪（美国菲尼根公司）测定。

  Ndff (%) = [植物样品中15N丰度(%)–15N自然丰度(%)] / [肥料中15N丰度(%) –15N自然丰度(%)]×100；氮肥分配率(%) = 各器官从氮肥中吸收的氮量(g) /总吸收氮量(g) ×100；器官全氮量(g) = 器官生物量(g) ×氮含量(%)；器官15N吸收量(g) = Ndff ×器官全氮量(g)；氮肥利用率(%) = 器官15N吸收量(g) / 施肥量(g) ×100。

  1.1.6 植株酶活性的测定

  1.1.6.1 NR活性的测定

  硝酸还原酶催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐可以与对氨基苯磺酸（对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（萘基乙烯二胺）在酸性条件下生成红色偶氮化合物，生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可以由产生的亚硝态氮的量表示。NR活性参照Savidov 和 Lips（1997）的测定方法进行改进。

  标准曲线的制作：取7支干净烘干的15ml刻度试管，依次编号1、2、3、4、5、6和7，分别按顺序加入亚硝酸钠标准液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0ml，蒸馏水2.0、1.8、1.6、1.2、0.8、0.4、0ml，再分别向各试管中按顺序加入4ml 1% 对-氨基苯磺酸、4ml 0.2% α-萘胺。摇匀，把各试管放在30℃保温箱中保温30min，然后在540nm波长下比色，根据结果绘制标准曲线，横坐标是亚硝态氮（μg）含量，纵坐标是吸光度。

  将葡萄幼苗的根、茎和叶片清洗干净后，每个样品称取1.0g，放在研钵里研磨，参照 Pinto等（2014）的方法用6 mL的提取缓冲液提取，4°C，8000 g离心5 min，获取上清液放入试管中并编号，用于测定NR活性。向各试管中加入KNO3-异丙醇-磷酸缓冲液混合液9ml，其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混匀作对照。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。将各试管置30℃下黑暗处保温30min，分别向处理管加1.0ml三氯乙酸，摇匀终止酶活性。最后将各试管静置2min，吸取上清液2ml加入另一组试管，以对照管做参比，按标准曲线做法进行显色测定，并计算酶活性。

  计算公式：样品中酶活性（μg/g.FW.h）=[C*V1/V2]/[W*t]

  C—反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg）

  V1—提取酶液时加入的缓冲液体积（ml）

  V2—酶反应时加入的粗酶液体积（ml）

  W—样品重量（g）

  t—反应时间（h）

  1.1.6.2 亚硝酸还原酶活性的测定

  亚硝酸还原酶活性参照Rao 等（1981）和Ozawa 和 Kawahigashi（2006）的方法测定。反应混合液包含1 mL 0.1 M 磷酸缓冲液（pH 7.5），0.05mL10 mM KNO2，0.05 mL 15 mg mL−1 甲基紫晶，0.2 mL 粗酶液和50 mg mL−1 溶解在100 mM NaHCO3的 连二亚硫酸钠（Na2S2O4）。此混合液在25℃下保温半小时直至甲基紫晶的颜色消失。反应剩余的NO2−的量用下述方法测定：0.2 mL上述反应剩余液，6.5mL的水，1.8mL 10% （w/v）磺胺（溶于浓HCl中），1.5 mL1%（w/v） 萘乙二胺。摇匀后在30℃下黑暗保温30min，然后在540nm波长下比色。

  1.1.6.3 谷氨酰胺合成酶活性的测定

  GS活性测定参照赵世杰等（2002）主编的《植物生理实验指导》。

  谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与Fe形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。

  提取缓冲液：

  0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，内含2mmol/LMg，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl调至pH8.0，最后定容至250ml；

  反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）：

  内含80mmol/L Mg，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O，0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml；

  反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：

  反应混合液A的成分再加入80mol/L盐酸羟胺，pH7.4；

  显色剂（0.2mol/L TCA，0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml； 40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。

  测定方法如下：

  （1）粗酶液提取 称取植物材料1g于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15，000g离心20min，上清液即为粗酶液。

  反应1.6ml反应混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5，000g下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6ml反应混合液A的为对照。

  （2）粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质。

  （3）结果计算：

  GS活力（A·mg-1protein·h-1）＝A

  /（P×V×t）式中 A—540nm处的吸光值；

  P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）；V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）； T—反应时间（h）。

  1.1.6.4 NADH-GOGAT活性测定

  NADH-GOGAT活性测定参照Singh和Srivastava（1986）以每min每mg反应混合液于30℃减少1 μmol的NADH为一个酶活单位，用μmol·h-1·g-1表示。提取液：0.2 M磷酸缓冲液（pH 7.5），2 mM EDTA，0.5%（v/v）Triton X-100，0.1%（v/v）巯基乙醇，和50 mM KCl.

然后在10，000 g 4℃离心20min，弃去沉淀，得到上清液。反应液：25 mM磷酸缓冲液（pH 7.3），酶提取液（0.3 mL），1 mM EDTA，5 mM 2-酮戊二酸，100 mM KCl， 20 mM l-谷氨酰胺，和1 mM NADH。在340nm下比色，测定消光值得变化。

  1.1.7 总RNA的提取、反转录

  将冻存的样品在液氮中迅速研磨成粉，取100mg组织样，用TIANGEN生产的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法提取样品的总RNA。从各器官提取的RNA各取2µL进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，使用大连宝生物公司DL 2000 DNA Marker 估测目的条带大小。cDNA第一链的合成参照试剂盒Primer ScriptTM RT Reagent Kit With gDNA Eraser（Takara）说明书。

  1.1.8 实时荧光定量PCR 分析（qRT-PCR）

  根据MOT1的cDNA序列设计荧光定量特异引物（表2-1），同时选用葡萄Ac t i n 基因为内参基因，并设计定量PCR引物FaMOT1-F和FaMOT1-R（表2-1）。使用大连宝生物公司SYBR Premix ExTaq（TaKaRa Biotechnology）试剂盒进行实时荧光定量，qRT-PCR 反应体系为25μL：SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，加去离子水至25 μL。每次试验设置3次技术重复。荧光定量PCR 反应程序为：95 °C预变性30 s，95 °C变性5 s，60 °C退火30 s，40 次循环，所有PCR 反应都设3 次生物学重复和3次技术重复。使用SYBR Green法在Bio-RAD CFX connect实时荧光定量PCR仪上进行RT-qPCR实验，试验结果用2-ΔΔCT 法对数据进行定量分析。

  1.1.9 数据处理

  试验数据采用SPSS18.0 软件进行单因素方差分析，LSD 法进行差异显著性检验，应用Microsoft Excel 2003和Graphpad Prism 5绘制图表。

  1.2 结果与分析

  1.2.1 钼对不同氮源下植株生长、干重、根系构型和根系活力的影响

  如图1所示，不同氮源条件下，生长在含Mo的培养液条件下植株长势优于不含Mo的培养液条件下的葡萄植株。

 

  如表1所示，在不同施氮形式中，NH4NO3的植株干重最高，而NH4+的植株干重最低。在NO3-、NH4NO3和NH4+处理下，施用钼使葡萄幼苗的茎部干重分别提高了10.40%、15.73%和9.94%，根系干重分别提高了16.43%、34.84%和15.88%。与不施钼处理相比，施用钼显著提高了植株干重。

 

  如表2所示，不同氮源条件下，施用NH4NO3导致根系结构参数和根系活性最高，而单独施用NH4+导致根系结构参数和根系活性最低。Mo处理显著增加了葡萄幼苗的根长、根体积、根表面积、根分叉、根尖和根系活力。同时，-Mo和+Mo处理的平均根径差异不显著。与-Mo相比，在NO3-、NH4NO3和NH4+源下，Mo处理的根系活力分别提高了28.97%、32.92%和25.92%。

 

  1.2.2 钼对不同氮源下植株钼浓度、叶绿素含量、氨基酸含量和可溶性蛋白含量的影响

  氮肥处理下，施钼显著提高了葡萄幼苗地上部和根部的钼浓度。NH4NO3处理下，葡萄幼苗根部的钼浓度明显高于单独施用NO3-或NH4+处理。但不同氮源下，不施用钼的葡萄幼苗地上部和根部的钼浓度差异不显著(表3)。

  在NH4NO3处理下，-Mo和+Mo处理的葡萄幼苗叶绿素(a+b)含量最高(表3)。与-Mo处理相比，施用Mo提高了NO3-和NH4NO3源下的叶绿素(a+b)含量，但叶绿素b含量和叶绿素a/b比值没有差异(数据未显示)。

  以NH4NO3为氮源的幼苗氨基酸含量最高，与葡萄藤幼苗根、芽中可溶性蛋白含量一致(表3)。

 

  1.2.3 钼对不同氮源下植株全N、NO3-和NH4+含量的影响

  如表4所示，不同供氮处理的幼苗根系氮含量差异显著，NH4NO3处理的幼苗枝条氮含量高于NO3-和NH4+处理。钼增加了葡萄幼苗茎部和根部的总氮含量。添加钼后，NH4NO3处理的总氮含量最高。分析了根部和茎部的NO3-浓度。与单独使用NH4+相比，单独使用NO3-和共施用NH4NO3时，Mo的供应明显降低了NO3-的含量。

 

  1.2.4 施用钼提高了不同氮源下葡萄幼苗氮素吸收和氮肥利用效率

  15N标记试验表明，在NH4NO3条件下，施用Mo后，茎和根对15N的吸收量最高(表5)，说明NO3-与NH4+共施时Mo与N具有互补效应。NH4NO3混合处理下，Mo处理的15NUE最高。在NO3-、NH4NO3和NH4+源下，施用Mo可使幼苗15NUE分别提高38.54%、49.26%和26.38%(表5)。

  1.2.5 钼对氮素代谢酶活性及VvMOT1和VvNRT1.1基因表达的影响

  在NO3-和NH4NO3源下，葡萄幼苗根和芽中NR活性均较高(表6);而在仅以NH4+为氮源的葡萄幼苗中，+Mo和-Mo处理之间没有差异(表6)。同时，Mo培养的葡萄幼苗叶片和根系的NiR活性高于未Mo，特别是在NH4NO3存在的情况下(表6)。

  施钼显著提高了NH4NO3源下葡萄幼苗根系GS活性(表6)。同时，施钼的葡萄幼苗在所有源下的茎部GS活性均显著高于未施钼的葡萄幼苗(表6)。葡萄幼苗NADH-GOGAT活性也有类似的变化趋势(表6)。

  在氮源存在的情况下，Mo的应用上调了芽和根中VvMOT1基因的表达(图2、A和B)，表明Mo在激活VvMOT1转录物中的作用。在Mo处理下，当N源为NH4NO3时，VvMOT1在根和芽中的表达量均达到最大值(图2、a、B);VvMOT1表达量与Mo浓度一致。同时，施钼和不同形态的氮素影响了VvNRT1.1的转录水平(图2、C和D)。施钼显著提高了氮素处理下葡萄幼苗根和芽中VvNRT1.1的表达。

 

  1.3 结论

  在葡萄幼苗中，氮素形态和钼的施用对干重、根系构型和活性有显著影响。施钼可提高组织Mo水平，确保有足够的Mo用于氮的同化。此外，氮素形态和钼的施用对叶绿素含量、氨基酸含量和可溶性蛋白质含量也有影响。Mo诱导了VvMOT1和NRT1.1的表达，保证了Mo和N的充分吸收。氮同化相关酶(NR、NiR、GS和NADH-GOGAT)活性指数升高，降低了组织NO3-含量，提高了NH4+含量。随着氮同化相关酶(NR、NiR、GS和NADH-GOGAT)活性的提高，组织NO3-含量降低，NH4+含量增加，表明NH4NO3和Mo的供应改善了氮素的吸收和同化。不同氮源下施用钼后，氮素吸收和氮素利用率均有所提高，表现出钼和氮的协同效应。这表明硝态氮营养下钼对葡萄氮素吸收、利用的促进作用大于单一铵态氮，尤其在NO3-和NH4+都存在的条件下，钼表现出更好的协同作用。这为生产上葡萄育种工作提供了氮肥高效吸收利用的农艺措施。