加工与综合利用岗位

兰义宾

  1 研究目的意义

  葡萄酒中的单糖苷花色苷能够与羟基肉桂酸结合生成酚基型吡喃花色苷，从而降低了发酵体系中羟基肉桂酸的含量。值得注意的是，与欧亚种葡萄酒相比，东亚种葡萄酒更容易带有烟熏味的感官特征，且3种东亚种样品中乙基酚类物质的含量均普遍较高。而东亚种群葡萄酒与欧亚种葡萄酒中花色苷类物质的组成具有较大差异：欧亚种葡萄酒中含有大量单糖苷花色苷，而东亚种群葡萄酒中以双糖苷花色苷为主，不含或是仅含少量的单糖苷花色苷。基于以上的既有理论和研究结果，我们推测不同花色苷组成可能会对乙基酚类物质的积累造成影响。为验证这个推测，本研究通过花色苷标准品添加发酵实验，探究发酵基质中不同花色苷组成是否会对乙基酚类物质的积累造成影响。

  2 材料与方法

  2.1 花色苷添加发酵实验

  花色苷添加发酵实验在40 mL刺葡萄汁中分别添加不同的花色苷（二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷）进行发酵实验。

  设计实验组如下：（a）对照组（CK）：40 mL刺葡萄汁。（b）添加单糖苷花色苷（O）：40 mL刺葡萄汁添加3 mg二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷。（c）添加双糖苷花色苷（M）：40 mL刺葡萄汁添加3 mg二甲花翠素-3,5-O双葡萄糖苷。每种发酵体系做3组生物学重复，在酒精发酵结束点取样。

  2.2 乙基酚和乙烯基酚的检测

  乙基酚和乙烯基酚的检测采用GC-QqQ-MS/MS技术检测样品中4-乙烯基苯酚、4-乙基苯酚、4-乙基愈创木酚和4-乙烯基愈创木酚的浓度。

  2.3 乙基酚主要前体物的检测

  采用HPLC-QqQ-MS/MS技术检测羟基肉桂酸及其糖苷态物质。

  2.4 花色苷及其衍生物的检测

  利用Agilent 1200-6410B高效液相色谱-三重串联四级杆质谱联用（HPLC QqQ-MS/MS，AgilentTechnologies，SantaClara，CA，美国）对花色苷类物质进行检测。样品测定前经0.22 μm水系滤膜过滤，进样量5 μL，每个样品做两个独立技术重复。

  （1）花色苷衍生物分析方法

  洗脱程序为：1 min：100%的A；3 min：25%的B；15 min：30%的B；20 min：100%的B；25 min：100%的B；后运行时间5 min。柱温箱温度为55 ℃，流速为0.3 mL/min。进样量为5 μL。质谱仪采用电喷雾离子源（ESI），其参数为：正离子模式，喷雾电压为4 kV干燥气和雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氮气。雾化器压力为0.241 Mpa（35.0 psi），干燥气流速为12.0 L/min，温度为350 ℃，离子源温度为150 ℃。

  （2）花色苷分析方法

  洗脱程序为：0~10 min，10%~100% B；洗脱结束后，维持10% B冲洗5 min，平衡色谱柱。流速0.4 mL/min，柱温：55 ℃。质谱仪采用电喷雾离子源（ESI），其参数为：正离子模式，喷雾电压为4 kV干燥气和雾化气为高纯氮气，碰撞气为高纯氮气。雾化器压力为0.241 Mpa（35.0 psi），干燥气流速为12.0 L/min，温度为350 ℃，离子源温度为150 ℃。

  2.5 数据统计与分析

  单因素方差分析（ANOVA，Duncan，P<0.05）采用SPSS 20.0软件（SPSS，芝加哥，美国）进行。图形使用Origin Pro 9.1绘制。

  3 结果与讨论

  3.1 发酵后花色苷衍生物分析

  对发酵后样品中的5种花色苷进行定量分析，对照组（CK）和双糖苷花色苷添加组（M）中检测到较高含量的二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷和甲基花青素-3,5-O-双葡萄糖苷，并未检测到二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和酚基型吡喃花色苷（表 1）。而在单糖苷添加组（O）中检测到了二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和两种酚基型吡喃花色苷。在实验组中添加了等质量浓度（75 mg/L）的单糖苷花色苷（O）和双糖苷花色苷（M），发酵后检测到O组中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的浓度为3.56 mg/L，M组中二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷的浓度比对照增加了约23 mg/L（表1）。两种花色苷在发酵后的剩余量均低于其添加量，尤其是单糖苷花色苷，在发酵后的剩余量不足添加浓度的10%，说明与双糖苷相比单糖苷花色苷更不稳定，在发酵过程中容易降解或是生成其它的物质。值得注意的是，检测到O组中生成了酚基型吡喃花色苷，由于花色苷类物质的C4位带正电荷，因此极易与其它具有极性双键的物质发生反应。通过加环反应与氧化反应，花色烊离子与这些物质结合，并在原有的结构基础上形成一个新的吡喃环，其中羟基肉桂酸和乙烯基酚类物质具有极性双键，可以与花色苷结合形成酚基型吡喃花色苷。检测到O组中生成二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基苯酚（malvidin-3-O-glucoside-4-vinylphenol，Mv-vpol）浓度为224.64 μg/L，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基愈创木酚（malvidin-3-O-glucoside-4vinylguaiacol，Mv-vgol）浓度为635.46 μg/L。依据一分子吡喃花色苷需要结合一分子乙烯基酚或是一分子羟基肉桂酸进行计算，理论上Mv-vpol的形成需要消耗44.26 μg/L乙烯基苯酚或60.12 μg/L的对香豆酸；Mv-vgol的形成需要消耗149.17 Mv-vgol乙烯基愈创木酚或191.93 Mv-vgol的阿魏酸。

  注：a Mv-glc，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（Malvidin-3-O-glucoside）；Pe-diglc，甲基花青素-3,5-O-双葡萄糖苷（Peonidin-3,5-O-diglucosides）；Mv-diglc，二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷（Malvidin-3,5-O-diglucosides）；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基苯酚（Malvidin- 3-O-glucoside-4-vinylphenol ）； Mv-vgol，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷-4-乙烯基愈创木酚（Malvidin-3-O-glucoside-4-vinylguaiacol）。b nd，表示该物质在样品中未检出。

  3.2 发酵后乙基酚及其前体物分析

  本研究表明，单糖苷花色苷在发酵过程中能够抑制羟基肉桂酸及其糖苷态形式的转化，同时还能结合发酵生成的乙烯基酚形成酚基型吡喃花色苷，使发酵后生成的乙烯基酚浓度显著降低。而双糖苷花色苷在发酵过程中对羟基肉桂酸脱羧反应的抑制效果弱，且由于其C5位连接糖苷形成空间位阻，不能结合乙烯基酚生成吡喃花色苷。双糖苷花色苷的添加不能降低乙烯基酚的浓度，反而可以促进乙烯基酚的积累。东亚种群和山欧杂种葡萄酒中以二甲花翠素-3,5-O-双葡萄糖苷为主（含量范围在20.06 μg/L至468.1 μg/L之间），而欧亚种葡萄酒中以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷为主（含量范围在17.75 μg/L至107.7 μg/L之间），在发酵过程中利于乙烯基酚的积累。与欧亚种葡萄相比，东亚种群和山欧杂种葡萄中缺乏单糖苷花色苷，对羟基肉桂酸脱羧反应的抑制效果较差，同时也不能结合乙烯基酚生成酚基型吡喃花色苷，缺乏乙烯基酚转化生成酚基型吡喃花色苷的代谢流向，导致更多乙烯基酚在葡萄酒中积累。

  4 结论

  本研究通过不同花色苷添加发酵实验，探究花色苷组成对乙基酚生成的影响，添加单糖苷花色苷发酵后生成的4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈创木酚浓度与对照相比分别降低了29.5%和26.8%,剩余羟基肉桂酸的浓度显著高于对照，且发酵后检测到酚基型吡喃花色苷。添加双糖苷花色苷发酵后生成的4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈创木酚浓度与对照相比分别增加了27.3%和28.0%，发酵后并未检测到酚基型吡喃花色苷。