酿酒葡萄栽培岗位

房玉林 张克坤 李磊

 

  1 目的意义

  中国有很多栽培酿酒葡萄的产区，不同的产区有着气候和生态环境特点，而影响酿酒葡萄品质的因素很多，光照、温度、湿度和水分等以及土壤营养条件及土壤结构都对葡萄果实品质产生影响。光照是葡萄生长发育的必备条件，光照强度、日照长度、光谱成分的不同都会影响葡萄与葡萄酒的品质。良好的光照条件与浆果着色、品质、产量的形成等都密切相关。

  山东的气候属暖温带季风气候类型。特点是降水集中,雨热同季,春秋短暂,冬夏较长。成熟期的阴雨存在糖含量不足，综合品质受到限制等问题。因此，调控酿酒葡萄叶幕光环境对酿酒葡萄品质有着重要的作用。

  2 材料与方法

  2.1 材料

    

  供试品种为酿酒葡萄品种马瑟兰，位于山东蓬莱的中粮长城葡萄酒基地。

  2.2 试验设计

   

 

  在山东蓬莱的中粮长城葡萄酒基地，对马瑟兰葡萄品种在地面水平铺设三种材质的反光膜来增强叶幕的光照强度，进行六种反光膜铺设方式：铝塑反光膜1m水平处理、铝塑反光膜0.5m水平处理、绿色园艺布1m水平处理、绿色园艺布0.5m水平处理、白色园艺布1m水平处理、白色园艺布0.5m水平处理。

  2.3 测定方法

  2.3.1 果实生长指标测定

  百粒重

  从每个果穗的上中下三个部位随机选取20个果粒，之后将所有果粒混合后选取100粒，在电子天平上称重，计算单粒重，并重复三次操作计算平均值。

  2.3.2 果实基本理化指标测定

  可溶性固形物：手持测糖仪测定。

  pH值：pH计测定。

  滴定酸：滴定法测定

  总糖（葡萄糖）：参考王华(1999)的方法测定

  有机酸：样品榨汁，5000g离心，-40℃保存备用。样品在实验室室温下融解，充分摇匀后吸取样1 mL，稀释5倍，用0.22μm微孔膜过滤，备用。采用 Waters1525高效液相色谱系统，采用DIKMA Platisil NH2（250x4.6mm, 5μm）色谱柱；流动相25mM的磷酸二氢钾（磷酸调pH至2.5），流速1.0 mL/min，柱温25℃，采用waters2998二极管阵列检测器，检测波长210 nm。

  （2）葡萄酒基本理化指标测定

  残糖(以葡萄糖计)、总酸(以酒石酸计)、pH值等；酒精度、挥发酸、硫、干浸出物用FTIR葡萄酒分析仪测定。

  2.3.3 葡萄果实与葡萄酒中酚类物质测定

  （1） 葡萄与葡萄酒中酚类物质各分类的总量测定

  葡萄果皮中的酚类物质的提取参考江雨(2016)的方法利用盐酸甲醇溶液进行提取，将提取液置于-20 ℃冰箱中保存备用。

  ① 总酚。葡萄果实与葡萄酒总酚含量使用福林-肖卡法进行测定，结果以没食子酸计。

  ② 总单宁。葡萄果皮与葡萄酒中单宁的测定采用甲基纤维素沉淀法(MCP法)进行，结果以儿茶素计。

  ③ 总花色苷。葡萄果皮与葡萄酒总花色苷含量参考刘金串等（2012）的方法利用pH示差法进行测定，结果以矢车菊素-3-葡萄糖苷等价值表示。

  ④ 总黄烷三醇。葡萄果皮中的总黄烷-3-醇采用 p-DMACA-盐酸法进行。结果以(+)-儿茶素计。

  ⑤ 总类黄酮。葡萄果实与葡萄酒总类黄酮的测定参照Ivanova等（2012）的方法进行，略有修改，结果以芦丁计。

  （2） 葡萄与葡萄酒中单体酚类物质测定

  ①葡萄皮与葡萄酒中花色苷物质的提取检测

  A. 果皮中花色苷提取检测方法如下：

  准确称取0.250 g(记录)葡萄皮干粉于50 mL 离心管，加入5 ml 提取剂，提取剂由甲醇:甲酸（V:V）（分析纯）为98:2 的比例配制而成，避光超声10 min（超声温度保持20 ℃，功率为100 W），25 ℃条件下避光摇床震荡30min（130 r/min），然后 8000 g 离心 10 min，用1 mL 移液枪转移上清液至对应50 mL 离心管，如此提取步骤重复4 次，合并上清液（累计20 mL左右）并在 30 ℃条件下减压旋转蒸发至干燥，剩余物质用定溶剂（定溶剂为液相检测室流动相A:B  体积比为9:1配制）（流动相A:甲酸:乙腈:水=2:6:92,流动相; B:甲酸:乙腈:水=2:54:44）定容为5 mL。样品于-80 ℃ 冰箱保存以备上机检测。每生物学重复取一次。

  花色苷物质检测采用Agilent 1100系列 LC/MSD Trap-VL液相色谱-离子阱质谱联用仪配有二极管阵列检测器（DAD）进行样品的定性和定量分析。流动相 A：甲酸：乙腈：水=2:6:92，流动相 B：甲酸：乙腈：水=2:54:44。流动相洗脱程序如下：1~18 min，10%~25% B；18~20 min，25% B；20~30 min，25%~40% B；30~35 min，40%~70% B；35~40 min，70% ~100% B。流动相的流速为 1.0 mL/min；柱温为50 ℃；检测波长为525 nm；波长扫描在200~900 nm；进样量为30 µL。质谱条件为：电喷雾离子源（ESI），正离子模式。离子扫描范围为100~1500 m/z；雾化器压力为35 psi；干燥气流速为12 L/min；干燥气温度为300 ℃。每个样品重复进样两次，做为2次技术重复。

  花色苷定量以二甲花翠素葡萄糖苷为外标物做标准曲线，检测出的花色苷类物质均以二甲花翠素葡萄糖苷的含量计，果皮中花色苷浓度单位用mg/kg（果实鲜重）表示。

  B. 葡萄酒花色苷酚类物质检测方法如下：

  取2 ml待测酒样，离心，经过0.45 µm的无机滤膜（聚醚砜）过滤，样品直接进行HPLC-MS分析。葡萄酒花色苷类物质的HPLC-MS检测方法同葡萄果实花色苷HPLC-MS检测方法。

  ②葡萄皮与葡萄酒中非花色苷酚类物质的提取检测

  A.果皮中非花色苷酚类物质的提取检测如下：

  准确称取1 g葡萄皮干粉于50 mL 离心管中，加入1 mL 蒸馏水和9 mL 乙酸乙酯(分析纯)，25 ℃ 条件下避光摇床震荡30 min(摇床转速 130 g)，8000 g 离心5 min，用1 mL 移液枪转移上清液于对应50 mL 离心管中，重复4次(上清液加黑色袋遮光)，合并上清液(累计40 mL左右)于旋转蒸发仪33℃蒸发至干，色谱甲醇定容至1 mL。

  实验采用 Agilent 1200 系列 LC/MSD 离子阱液相色谱-质谱联用仪，包括在线G1379A 真空溶剂脱气机、G13llA 四元高压梯度泵、G1313A 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1315A 二极管阵列检测器(DAD)。色谱柱采用反相 250 mm×4.6 mm，5 μm的Zorbax SB-C18柱(Agilent Technologies)，流动相 A：1.0% 的醋酸水溶液；流动相 B：1.0% 醋酸甲醇溶液；洗脱程序；0-15 min，10%-26% B；15-30min，26%-40% B；30-50 min，40%-65% B；50-60 min，65%-95% B；60-63 min，95%~10% B；63-66 min，10% B isocratic；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样量：10 μL。MSD 参数：离子源为ESI，采用负离子模式；雾化气压力为 30 psi；干燥气流速为 10 mL/min；干燥气温度为325 ℃；离子扫描范围为100-1500 m/z。CID的MS/MS 诱导碰撞能量为1.0 V。

  配制8个浓度水平的混标，每个水平重复 3 次，以各组分的平均峰面积（Area）对浓度（Amt，mg/L）在工作站中建立标准曲线，通过标准曲线计算果皮(干重)中非花色苷酚含量，单位为 mg/g。

  B.葡萄酒中非花色苷酚类物质提取检测如下：

  取2 ml待测酒样，离心，经过 0.22 µm 有机滤膜（尼龙）过滤，然后进行HPLC-MS/MS分析。采用 Agilent1200 系列 LC/MSD Trap-VL 高效液相色谱-离子阱质谱联用仪对提取产物进行检测。流动相 A 为 10%（V:V）乙酸水溶液，流动相B为90%乙腈（V:V）和10%乙酸溶液，流动相洗脱梯度为：0~5 min, 5.0~8.0% B；5~7 min，8.0~12.0% B；7~12 min，12.0~18.0% B；12~17 min，18~22% B；17~19 min，22~35% B；19~21 min，35~100% B；21~25 min，100% B；25~27 min，100~5% B。流动相流速为 1.0 mL/min；柱温为 25℃；检测波长在 280 nm；进样量为2 µL；质谱采用电喷雾离子源（ESI），离子扫描范围：100-1000 m/z，负离子模式；雾化气压力为 35 psi；干燥气流速为 10 L/min；干燥气温度为 325℃；最大累计时间为 300 ms；Trap ICC：30000 units；CID 的 MS/MS 诱导碰撞能量为1.0 V。每个样品重复进样两次，做为 2 次技术重复。

  3 初步结果

 

  由表1可知：0.5m和1m宽度白色反光膜以及1m宽度铝制反光膜对葡萄果实百粒重有着提高作用，其中1m白色反光膜处理提高效果最为显著。0.5m和1m宽度白色反光膜处理、0.5m和1m宽度绿色反光膜处理均较对照组提高了pH值。除0.5m宽度绿色反光膜外其他处理组可滴定酸均相较于对照组降低了可滴定酸含量，0.5m宽度白色、绿色、铝制反光膜均较对照组提高了可溶性固形物含量，同时三种反光膜处理也显著提高了还原糖的含量，1m宽度的绿色、铝制反光膜也起到了提高还原糖含量的效果。

  如图2所示：二甲花翠素3-O-葡萄糖苷是单体花色苷组分中含量占比最高的，六种试验处理均对二甲花翠素3-O-葡萄糖苷含量有着提高作用，其中0.5m绿色反光膜处理效果最为显著，提高了52.32％，其次0.5m宽度铝制反光膜相较于对照组提高二甲花翠素3-O-葡萄糖苷含量47.74％。

 

  如图3所示：酒石酸是葡萄特有的有机酸，六种试验处理均降低了酒石酸的含量，其中0.5m和1m白色反光膜处理效果最为显著，分别降低了30.67％、27.01％。

 

  如图4所示：0.5m白色、绿色、铝制反光膜均相较于对照组提高了果实葡萄糖的含量，其中，0.5m宽度铝制反光膜对果实葡萄糖含量的提高最为显著，提升8.96％，同时三种反光膜0.5m宽度处理均比1m宽度处理对果实葡萄糖含量的提升作用更显著。

 

  如图5所示：0.5m白色、绿色、铝制反光膜均相较于对照组提高了果实果糖的含量，其中，0.5m宽度铝制反光膜对果实果糖含量的提高最为显著，提升7.74％，同时三种反光膜0.5m宽度处理均比1m宽度处理对果实葡萄糖含量的提升作用更显著。

  4 结论

  （1）反光膜处理对葡萄果实的葡萄糖、果糖、花色苷、可溶性固形物含量有促进作用。

  （2）0.5m宽度的反光膜相较于1m宽度的反光膜更适用于葡萄生长周期，对葡萄果实葡萄糖、果糖、花色苷、可溶性固形物等物质含量促进效果更为显著，同时更节约成本。

  （3）反光膜对葡萄果实有机酸含量起到了降低作用。

  5 尚需进行的工作

  尚需要对不同反光膜处理对葡萄果实和葡萄酒酚类物质及挥发性香气物质进行分析探究，寻求对烟台产区酿酒葡萄综合品质提高最好的反光膜铺设方式。