酿酒葡萄品种改良岗位

  基于SNP的靶向测序基因型检测的GBTs技术主要是通过在基因组DNA中，挑选特定的靶向位点进行测序和基因型检测。该技术目前已成功应用于大豆的基因分型、西兰花指纹图谱的构建等。近些年来，靶向测序基因型检测技术在木本植物研究中得到广泛应用。研究者利用该技术在多种次生代谢物的生物合成等相关基因的挖掘上取得一定进展。在梨属植物中，研究者利用该技术已经对梨果皮红色性状形成和梨果实脱宿萼等相关基因进行了挖掘，之后又在玉米等园艺作物的研究中应用。单宁作为葡萄果实中的特征性次生代谢物，其相关代谢通路基因的研究极其有限。培养营养富集型品种已成为现代育种者的重要目标。第二章的研究结果表明，杂交后代果实不同部位不同的单宁单体含量存在显著差异。因此为挖掘参与单宁合成相关的关键基因，本研究首先以‘黑比诺’和‘马瑟兰’及其杂交F1代株系为材料开展研究，分析100个株系果实单宁的含量并以此为基础利用GBTs方法，定位与单宁合成相关的候选基因，为葡萄单宁代谢通路的深入解析提供参考，为培育营养型葡萄品种奠定一定的理论基础。

  全基因组关联分析（GWAS）是基于自然群体中检测全基因组水平分子标记基因型信息从而开展群体中个体表型与基因型的相关性分析，进一步去解析影响复杂性状的基因变异，其具有高分辨率和高通量的优势。近年来，GWAS已广泛应用于水稻、小麦、辣椒、大豆和番茄等多种园艺植物，以解析其重要的农艺性状与基因型之间的关联的遗传结构。利用该技术有针对性地扩大和改良优良栽培番茄种质资源，为挖掘控制果实硬度、形状、重量、可溶性糖含量和成熟度的许多新的主要基因座提供了分子理论基础，为育种提供了有用的信息和见解，并为深入研究提供了进一步的机会以及在玉米开花时间和大豆群体中的异黄酮生物合成等相关基因的挖掘上取得一定进展。在葡萄中，研究中利用该技术已经对葡萄串性状等的候选基因进行了挖掘。单宁作为葡萄果实中的特征性次生代谢物，其相关代谢通路基因的研究极其有限。培养营养富集型品种已成为现代育种者的重要目标。第二章的研究结果表明，杂交后代果实不同部位不同的单宁单体含量存在显著差异。因此为挖掘参与单宁合成相关的关键基因，本研究首先以‘黑比诺’和‘马瑟兰’及其杂交F1代株系为材料开展研究，分析100个株系果实单宁的含量，对葡萄进行全基因组测序并以此为基础利用GWAS关联分析方法，定位与单宁合成相关SNP位点以及候选基因，为葡萄单宁代谢通路的深入解析提供参考，为培育营养型葡萄品种奠定一定的理论基础。

  1. 材料与方法

  1.1.试验材料

  试验材料为种植于山西农业大学果树研究所酿酒葡萄试验基地的‘黑比诺’、‘马瑟兰’和以‘马瑟兰’为母本‘黑比诺’为父本杂交的F1子代100个株系，进行统一田间管理。

  1.2.试验方法

  （1）样本采集

  2022年，采集‘黑比诺’、‘马瑟兰’和以‘马瑟兰’为母本‘黑比诺’为父本杂交的 F1 子代100个株系的叶片，液氮速存用于后续DNA提取和GBTs测序分析。

  （2）DNA样本提取与检测

  采用改良CTAB法进行样品 DNA 的提取。提取后的DNA样品进行2种检测：（1）使用1%琼脂糖凝胶电泳方法分析DNA的纯度和完整性；（2）使用Qubit对DNA浓度进行准确定量。

  （3）GenoBaits实验流程

  取定量质检合格的DNA利用超声波破碎仪进行随机物理破碎，破碎片段峰值控制在200-300 bp，破碎后的DNA经过末端修复后连接A尾。利用连接酶将加A后的DNA片段与测序接头连接在一起，然后利用羧基修饰的磁珠对文库进行纯化和片段选择，保留插入片段在200-300 bp的连接产物。连接产物加入带有Barcode的测序引物和高保真PCR反应体系进行PCR扩增，不同的Barcode用于区分不同的样品。经过羧基磁珠纯化后扩增产物，即可用于探针杂交实验。

  取500 ng完成构建的测序文库，冻干后加入探针与杂交试剂，变性后置于65℃温育2h即可完成杂交反应。杂交产物进行洗液清洗后，再进行一轮PCR完成杂交捕获文库的构建。

  （4） GenoPlexs实验流程

  在定量质检合格的 DNA 中加入多重PCR Panel mix 和多重PCR扩增酶体系，置于PCR仪上完成PCR反应。PCR产物利用羧基磁珠进行纯化后，再次计入带有Barcode的测序引物和高保真PCR反应体系进行PCR扩增，不同的Barcode用于区分不同的样品。经过羧基磁珠纯化后扩增产物，即完成多重PCR捕获及文库建库。

  （5） 文库构建及上机测序

  通过上述DNA质检合格的样品，使用相应的产品进行靶向测序文库构建，最终完成该项目全部样品的文库制备。文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，使用qPCR的方法对文库的有效浓度进行准确定量以保证文库质量。文库检测合格后，进入上机测序阶段。

  （6）全基因组关联分析

  根据F1 代葡萄果实不同部位中单宁单体GC和EC含量数据，用GEMMA通过混合线性模型进行GWAS分析，基于R语言用ggplot2 包绘制曼和顿图。用qqman绘制QQ图，另外以Bonferroni校正计算阈值，再根据实际情况进行调整，以-log10(P)＞4.5为标准，筛选GWAS获得的SNP信息。

  （7）候选基因初步筛选

  使用IGV-GSAman软件根据GWAS关联分析筛选出的 SNP 位点，提取并分析其前后25 kb区域内的所有基因，依据eggNOG网站对全部基因进行功能注释和筛选，初步获得可能与单宁代谢合成相关的基因。

  （8） qRT-PCR分析

  a. RNA提取

  使用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取亲本（黑比诺和马瑟兰）果皮，果肉，种籽总RNA。各个样品的总RNA提取参照植物多糖多酚RNA提取试剂盒（DP441，天根）说明书。并通过1%琼脂糖凝胶电泳初步检测提取RNA的质量，然后使用Agilent 2100检测RNA的浓度。

  b. cDNA合成及荧光定量体系

  根据试剂盒Hifair® III 1st Strand Cdna Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）说明书进行反转录。

  根据Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Master Mix试剂盒对该11个基因进行实时荧光定量分析。以Ubiquitin（UBQ）为内参，实时荧光定量PCR反应体系为： 7.5 LSYBR、1 LcDNA、0.3 L正向引物、0.3 L反向引物、5.9 LRNas-free水。反应程序为：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，60℃退火20 s，95℃延伸15 s，39个循环。

  c. 引物设计及合成

  根据关联分析后初步筛选出的有关单宁合成的候选基因的核苷酸序列，用TBtools进行引物设计，并由北京赛文创新生物科技有限公司合成。使用DEPC水溶解并稀释成工作液备用。

  2 结果与分析

  2.1全基因组关联分析

  全基因组关联分析（GWAS）是应用基因组中SNP作为分子遗传标记，进行全基因组水平上表型与marker的相关性分析，从而发现影响复杂性状的基因突变的一种策略。该研究利用2种模型对基因型和表型进行GWAS分析。共检索到5个候选SNP位点，其中有关EC合成的位点主要分布在Chr1、Chr6和Chr12上。有关GC合成的SNP位点主要分布在Chr2和Chr10上（图1）。为了筛选优异等位基因的准确性，将检测到的关联基因进行整理。

 

  2.2 候选基因的挖掘

  以25 kb作为SNP位点上下游的候选区间，并通过IGV-GSAman对50个候选区间进行基因扫描。根据SNP位点注释信息、基因表达水平以及相关研究报道，最终筛选出11个与EC和GC相关的候选基因，其中6个与EC的变化有关，5个与GC的变化有关。这些基因涉及多种类型，其中还包括了一些重要的转录因子。

  2.2.3 候选基因表达特征

  为进一步验证结果，选择11个基因进行荧光定量分析，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析基因在双亲（黑比诺和马瑟兰）果皮，果肉和种籽中的表达情况（图2），以Ubiquitin（UBQ）作为内参基因设置实时荧光定量程序。 结果显示筛选的11条基因中8条基因在黑比诺果皮中的表达量均高于马瑟兰。在果肉中，4条基因在黑比诺中的表达量低于马瑟兰。但是11条候选基因在马瑟兰果实种籽中的表达量均高于黑比诺的种籽。

  3 讨论

  植物的次生代谢物不仅对植物的生长发育有重要的作用，也常常被用作食品添加剂、药品制作、营养药品及农用化学品等产品和行业中。单宁具有软化心血管、抗癌和抗氧化等多种功效，酿酒葡萄是其重要的植物源。但目前，大多数研究者主要关注于葡萄单宁的提取和测定以及用途，但对单宁生物合成的基因尚未报道。本研究首先将黑比诺和马瑟兰的100份子代单宁及其单体含量与其测序结果进行GWAS关联分析。本研究检测到5个和单宁含量的SNP位点，11个候选基因在亲本果实不同部位中均有不同程度的表达。本研究共筛选出6个EC相关的关键候选基因和5个GC相关的关键候选基因。

  4 结论

  本章利用100份杂交后代在不同部位单宁各单体的含量结合GBTs液相芯片技术进行全基因组关联分析，检测到5个SNP 标记在果肉或果皮中分别与EC和GC的含量显著关联。通过对稳定关联标记邻近区间内基因进行功能注释分析，预测得到11个候选基因。以上结果可为葡萄单宁的遗传改良提供参考。