病毒病防控岗位

范旭东 董雅凤 张英

  葡萄浆果内坏死病毒（grapevine berry inner necrosis virus，GINV）于1997年在日本首次发现，并于2016年在国内首次报道，早期被认为是葡萄浆果内坏死病（最早称花叶病）的病原，最近表明GINV是引起我国葡萄扇叶衰退病的病原之一。感染GINV的葡萄植株生长缓慢，枝条上表现出内部坏死、节间缩短，叶片花叶且葡萄浆果表现出外部变色和内部坏死等症状。为降低GINV 对我国葡萄产业的危害，有必要建立灵敏、高效的实时荧光定量 PCR检测技术，为该病毒的监测与防控提供理论依据和技术支持。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  本实验所用样品种植在辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心毒源保存圃。

  1.2 引物设计

  根据GenBank 已登录GINV序列，用NCBI设计6 对RT-qPCR 检测引物（表 1），引物送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

  1.4 RT-qPCR反应体系优化

  以感染 GINV 葡萄样品的总 RNA 反转录合成的 cDNA 为模板，用不同退火温度（52.0、54.0、 55.9、58.4、60.3和 62.0 °C）进行 RT-qPCR 反应，选取Ct值小、扩增荧光值高且熔解曲线单一的退火温度；在最佳退火温度下，设置6个不同引物浓度（50、100、200、300、400 和 500 nmol/L）进行 RT-qPCR反应 ，选取Ct值小、扩增荧光值高且熔解曲线单一的引物浓度。

  1.5 RT-qPCR检测的灵敏度

  以100 ~ 10-7梯度稀释的感染 GINV 贝达葡萄样品的 cDNA 为模板，比较常规 RT-PCR 和 RT-qPCR 的检测灵敏度。

  1.6 RT-qPCR特异性检测

  从本实验室毒源保存圃采集已知感染其它病毒的样品，提取总RNA并反转录合成 cDNA用 于 RT-qPCR 特异性检测。

  1.7 田间葡萄样品检测

  在葡萄不同发育时期，从田间采集带GINV的品丽珠、贝达、SO4、101-14、140R和1103P的81个葡萄样品，采集部位为葡萄嫩叶片。分别采用常规 RT-PCR 和 RT-qPCR 对其进行检测，比较两种方法的 GINV 检出率。

  2 结果与分析

  2.1 引物筛选及鉴定

  RT-PCR结果显示，6对引物在阳性样品中都扩增到目的条带，在阴性样品中均未扩增到目的条带。其中，引物GINVRPYGF2/R2、GINVRPYGF3/R3和GINVCPYGF1/R1对6个阳性均扩增出明亮且单一的条带；引物GINVMPYGF1/R1、GINVCPYGF2/R2和GINVCPYGF3/R3对阳性的扩增条带较弱且存在较亮的引物二聚体（图1）。

  感染GINV样品的RT-qPCR 结果显示6对引物的熔解曲线为单一峰且 Ct 值小于 35，判定为阳性。但引物GINVMPYGF1/R1、GINVCPYGF1/R1、GINVCPYGF2/R2和GINVCPYGF3/R3对阴性和水对照的扩增结果融解曲线有峰且存在明显扩增曲线，因此选择引物GINVRPYGF2/R2和GINVRPYGF3/R3构建标准曲线。标准曲线结果显示，引物GINVRPYGF2/R2 的扩增效率为 101.6%， 相关系数为0.996 ；引物GINVRPYGF3/R3的扩增效率为 110.3%，相关系数为 0.988。 根据 RT-PCR和RT-qPCR 扩增及标准曲线结果，选择引物 GINVRPYGF2/R2 作为 GINV的 RT-qPCR 检测引物。

  2.2 RT-qPCR反应体系优化

  在 52.0 ℃～62.0 ℃间设置 6 个退火温度，不同退火温度RT-qPCR 扩增结果的Ct值相差不大，最大为17.17，最小为16.33（图2）。用6个不同引物浓度进行RT-qPCR扩增，结果显示不同引物浓度RT-qPCR 扩增结果的Ct值相差也不大，最大为16.9，最小为16.31（图3）。根据相对荧光值、Ct值和熔解曲线，选择58 ℃和300 nmol/L作为该反应体系的最佳退火温度与最佳引物浓度。

  将 RT-qPCR 反应体系的退火温度设为58 ℃，引物浓度设为 300 nmol/L ，以此构建标准曲线。结果显示，RT-qPCR的扩增曲线呈梯度分布，y=-3.283x+42.263，决定系数为 0.996，扩增效率 为101.6%。其决定系数较高，扩增效率较好，表明GINV RT-qPCR 检测体系初步构建成功。

  2.3 RT-qPCR检测的灵敏度

  常规 RT-PCR的检测结果表明其可检测到 1 × 10-2 稀释倍数的的 cDNA，而RT-qPCR 可检测到 1 × 10-5 稀释倍数的 cDNA，此时 Ct 值为32.46，仍小于 35，判定为阳性（图4）。表明RT-qPCR 的灵敏度为常规 RT-PCR 的1000 倍。

  2.4 RT-qPCR特异性检测

  利用所建立的技术体系对感染不同病毒（已知感染GINV、GPGV、GFabV、GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-7、GFKV、GVA和GRSPV）葡萄样品的cDNA进行GINV检测。结果显示除感染GINV病毒的葡萄样品外，感染其他病毒葡萄样品的cDNA均无明显扩增曲线，表明该技术体系可特异性检测GINV。

  2.5 田间样品检测

  常规 RT-PCR和建立的RT-qPCR对田间葡萄样品的检测结果显示，RT-qPCR 的GINV检测率高于常规 RT-PCR，其中，常规 RT-PCR的检出率为 85.19%，RT-qPCR 的检出率为 96.30/%。