育种方法与技术岗位

  葡萄稳定转化困难，遗传转化需时长且效率低，特别在对一些果实性状调控基因进行研究时无法开展功能验证工作。利用葡萄果实瞬时转化表达系统可以简单、便捷的鉴定果实性状相关基因功能，表达时间一般维持在10天左右，适用于巨峰等葡萄品种。

  试验材料与试剂。

  1、挑选生长健壮且生长势较一致的葡萄树（巨峰葡萄）为试验材料；实验使用根癌农杆菌菌株GV3101，植物载体为pHB；实验中主要用的药品包括MES-KOH、MgCl2、acetosyringone、DMSO、LB培养基、利福平、卡那霉素等；注射用悬浊液配置浓度为：（10mM MES-KOH (PH5.2), 10mM MgCl2, 100 uM acetosyringone）。

  2、实验步骤。

  （1）农杆菌活化：使用LB固体抗性培养基（含卡那霉素、利福平）进行菌株划线，于28℃培养箱中倒置培养16 h-20 h；随后挑取单克隆于500 μl LB液体抗性培养基中，于28℃摇床中培养12 h左右，转速为200 rpm；初次活化后，吸取100 μl菌液接入200 ml LB液体抗性培养基中，于28℃摇床中培养12-16 h左右至OD600 0.6-0.8。室温静置2-3 h。

  （2）农杆菌收集及侵染菌液制备：10000rpm，1min室温离心，除去培养基，用1-2ml悬浊液悬浮菌体（可涡旋震荡）。用分光光度计测定OD600，将菌体悬浊液调整至OD600=0.6-0.8。室温静置2h。菌液使用前涡旋震荡或用枪吸打悬浮菌体，用带有针头的1 ml注射器吸取菌液待注射使用。

  （3）果实瞬时注射：选择果实发育硬核期-转色期的葡萄果实样品，1 ml注射器吸取菌液，将注射器针头插入葡萄果粒，慢慢用力，注射后的部分的颜色会变暗，做好标记。注射方向可从果实底部或者果柄插入。建议在葡萄果粒绿熟期进行操作，注射量根据果实硬度响应调整，不易超过1ml。重复数量不少于50粒果实样品，且在5棵植株开展实验。注射时期过早，不容易注射成功。

  （4）基因瞬时表达效果检测：将注射果实与对照进行表型对比，统计表型数据；采用CTAB法提取葡萄叶片RNA，利用DNase I消化RNA中残留的DNA，随即将RNA反转录成cDNA。以稀释20倍的cDNA为模板进行qPCR验证；