无核种质材料创制岗位

徐炎 王跃进 张朝红 刘国甜

  选用40对葡萄特异性SSR引物对无核胚挽救杂交组合的亲本材料红宝石、巨玫瑰、妮娜皇后、魏可、春光、玫瑰香、中国红玫瑰、阳光玫瑰、火焰无核、红旗特早、火州黑玉、底莱特、瑰宝进行PCR扩增，初步筛选出具有差异、多态性好、扩增稳定且带型清晰的特异性引物，以便后期对葡萄杂交后代进行真实性鉴定。实验方法如下：

  （1）对13份亲本材料进行DNA提取，对其DNA质量和浓度检测；

  （2）8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选 ：1.制胶：在体积为50 mL8% PAGE 胶液中分别加入13.5 mL30%聚丙烯酰胺母液、10%APS 500 μL、31.5 mLddH2O、50 μLTEMED和5 mL10×TBE。迅速混匀后立即灌胶，待胶液灌满整个玻璃板夹层后，迅速将0.4 mm 厚鲨鱼齿梳齿整齐的轻轻插入胶液。平放在桌面上，胶液在室温25℃下静置聚合1 h 以上。2.放置胶板：胶液聚合后，将胶板表面溢出的胶液清理或刮除，放置电泳槽里，将梳子两端轻轻拔出，在电泳槽里倒入1×TBE缓冲液，超过点样孔即可，槽两端电泳缓冲液的高度要没过电阻丝，电流形成通路后即可进行电泳。3.点样：在扩增后PCR产物中加入2 μL 6×Loading Buffer，混合后上样。每一个加样孔点样0.5 μL～2 μL，在胶板两端点入DNA Marker。4.电泳：在30 W～40 W恒功率、180 v恒压下电泳约1.5 h。5.取胶；6.银染：a.漂洗：在染色托盘中加入1000 mL 蒸馏水漂洗1次（约30 s），倒掉蒸馏水；b.染色：加入0.1% AgNO3 溶液，在摇床上转速30 rpm染色15 min；c.漂洗：倒掉染色液至回收瓶中，用蒸馏水摇晃漂洗2～3次，时间约30 s，清洗干净后倒掉托盘中蒸馏水；d.显影：在染色托盘中加入显影液，迅速振动，使显影液均匀覆盖每块凝胶，然后在摇床上慢速摇动，直至显影；e.洗涤：待凝胶显影清晰后，回收显影液，加入蒸馏水至托盘中轻轻摇晃清洗凝胶2 次，直至彻底去掉显影液，以免保存凝胶时变色；f.保存：凝胶上面覆盖保鲜膜，统计带型，拍照保存。

选用40对引物对19个杂交组合的亲本进行多态性引物筛选，初筛结果如下：

  1.红宝石×巨玫瑰，多态性引物3对：VVIN52、VMC1C10、Vchr18a；

  2.红宝石×妮娜皇后，多态性引物3对：VrZAG79、VVIB66、Vchr18a；

  3.魏可×巨玫瑰，多态性引物3对：VVMD27、VrZAG67、VVIB66；

  4.魏可×妮娜皇后，多态性引物3对：UDV120、VVIP26、VVIB66；

  5.魏可×春光，多态性引物1对：VVMD27；

  6.妮娜皇后×玫瑰香，多态性引物2对：VrZAG67、Vchr8a；

  7.中国红玫瑰×巨玫瑰、巨玫瑰×中国红玫瑰，多态性引物2对：VVS2、VVIB66；

  8.中国红玫瑰×妮娜皇后、妮娜皇后×中国红玫瑰，多态性引物2对：UDV120、VrZAG67；

  9.阳光玫瑰×巨玫瑰、巨玫瑰×阳光玫瑰，多态性引物2对：VrZAG67、VMC1C10；

  10.阳光玫瑰×妮娜皇后、妮娜皇后×阳光玫瑰，多态性引物4对：VVIN52、VrZAG67、VMC1C10、Vchr3a；

  11.火焰无核×红旗特早，多态性引物2对：VMC4F3-1、VMC4F8；

  12.底莱特×红旗特早，多态性引物8对：VVIM11、VVMD32、VrZAG62、VrZAG93、Vchr8a、Vchr16a、Vchr17a、SCU06；

  13.底莱特×瑰宝，多态性引物5对：VVIM11、VVMD7、VVII52、VVIP31、VMC4F8、Vchr13b

  14.火州黑玉×阳光玫瑰，多态性引物8对：UDV120、VVMD32、VrZAG93、VMC4F3-1、VMC4F8、VMC5G8、Vchr16a、Vchr18a；

  15.火州黑玉×中国红玫瑰，多态性引物5对：UDV120、VVIM11、VVII52、VrZAG93、SCU06。