兰州综合试验站

朱燕芳 郝燕

  摘  要：为了分析枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）对葡萄幼苗生长及生理特性的影响，本试验通过水培的方式，设置不加BS菌剂（CK）、加入0.1 mg·L-1 BS菌剂（T1）、加入0.5 mg·L-1 BS菌剂（T2）和加入1.0 mg·L-1 BS菌剂（T3）共4种处理，检测不同处理下葡萄叶片叶绿素、光合参数、荧光参数、抗氧化酶活性、根系构型及根系活力等指标，探讨BS菌剂对葡萄幼苗生理特性及根系的影响。结果表明：T2葡萄叶片的相对叶绿素和叶绿素b在第10 d分别比CK高6.38%和19.60%，叶绿素a在第20 d比CK高13.67%，类胡萝卜素在第15 d比CK高33.25%。T1葡萄叶片的光合参数（Pn、Gs、Ci和Tr）效果最好，Pn 在第20 d比 CK高69.79%，Ci在第15 d比 CK高24.61%。T2葡萄叶片的荧光参数（F0、Fm和Fv/Fm）效果最佳，F0和Fm在第15 d比 CK分别提高了20.76%和36.73%。T1葡萄幼苗的抗氧化酶（CAT、POD）在第15 d比 CK分别高37.11 %和45.79%，T2葡萄幼苗的SOD在第15 d比 CK高60.28%。T1和T2处理葡萄幼苗的根系生长及根系活力显著高于CK，根系活力较CK分别提高了73.70%和60.21%。采用主成分分析对各项指标进行综合评价，结果表明0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1 BS菌剂均能更好的促进葡萄幼苗的生长。

  关键词：葡萄；枯草芽孢杆菌；光合作用；抗氧化酶；根系生长

  1 材料与方法

  1.1 试验材料及处理

  试验于2024年3~5月在甘肃省农科院林果花卉研究所实验室中进行。以葡萄扦插苗为试材。2024年3月13日将葡萄扦插苗定植在自动化管理的温室中的基质上，待其长出根须及叶片后，在4月26日移植到育苗盘（直径为17.5 cm，下直径为13.5 cm，高为7.5 cm）。加入不同浓度的BS菌剂（0.1 mg·L-1的BS菌剂（T1）；0.5 mg·L-1的BS菌剂（T2）；1.0 mg·L-1的BS菌剂（T3）），配制菌剂用水为超纯水，以超纯水处理为对照（CK），每盆水溶液含量为2 L，每5 d换一次溶液，每个试验处理10株，3次重复，每5 d采样1次，测定各项指标。    

  1.2 指标测定

  采用SPAD-TYS-4N叶绿素测定仪测定相对叶绿素含量。参考王学奎[20]的方法测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。擦净葡萄叶片的表面污物，剪碎（去掉中脉）混匀。称取剪碎的新鲜样品0.2 g，共3份，分别放入研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙粉及95%乙醇2~3 mL，研磨成匀浆，再加入95%乙醇10 mL，继续研磨至变白。静置3~5 min。将提取液倒入25 mL的棕色容量瓶中，用乙醇定容至25 mL，摇匀。分别将样品提取液倒入光径1 cm的比色皿中，以95%乙醇为空白对照，在波长665 nm，649 nm和470 nm处测定OD值。叶绿素a的浓度Ca=13.95A665- 6.88A649；叶绿素b的浓度Cb=24.96A649-7.32A665；类胡萝卜素的浓度Cx·c=(1000A470- 2.05Ca- 114.8Cb)/245。

  采用便携式光合测定仪（Li-6400，LI-COR，德国）测量叶片的净光合速率（Net photosynthetic rate，Pn）、气孔导度（Stomatal conductance，Gs）、胞间 CO2 浓度（Intercellular CO2 concentration，Ci）和蒸腾速率（Transpiration rate，Tr）等光合气体交换参数。参考郭建辉等[21]的方法，将叶片在黑暗条件下暗处理30 min，采用连续激发式荧光仪Handy-PEA（Hansatech，英国）测定葡萄幼苗叶片的初始荧光值（Initial fluorescence value，F0）、最大荧光值（Maximum fluorescence value，Fm）和PSⅡ最大光化学效率（Maximum photochemical efficiency of PSⅡ，Fv/Fm）参数。

  采用氮蓝四唑（NBT）法测定葡萄叶片的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性、采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性、采用愈创木酚法[19]测定过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性；采用氯化三苯基四氮唑（TTC）还原法[22]测定葡萄根系活力。采用W RHIZO全自动根系分析系统测定总根长、根表面积、根体积、根平均直径、总根尖数、总分支数以及总交叉数。

  1.3 数据分析

  利用Excel进行数据处理，通过Origin 2019软件作图，再通过SPSS27.0软件进行方差分析，采用Duncan’s多重比较法进行差异显著性检测。

  2 结果与分析

  2.1 不同浓度BS对葡萄叶片叶绿素变化的影响

  如图1所示，CK、T1和T2叶片的相对叶绿素、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素浓度均随着处理时间的增加而增加，而T3随着处理时间的增加呈先升后降的趋势。如图1-A所示，在第5 d和10 d时，T2显著高于CK和T3，且分别比CK高3.24%和6.38%。在第15 d，CK与T1和T2无显著差异，但均显著高于T3。在第20 d，T2的相对叶绿素最高为29.57，T1和T2显著高于CK和T3，且分别比CK高4.52%和5.60%。如图1-B所示，在第5 d，T1和T2显著高于CK和T3，而CK和T3无显著差异。在第10 d和15 d，3个处理组均显著高于CK，其中T2最高，分别比CK高8.94%和9.89%。在第20 d，T2的叶绿素a浓度最高为16.12 mg·g-1，T1和T2显著高于CK和T3，且T1和T2分别比CK高6.52%和13.67%，而T3却显著低于CK，比CK低54.92%。如图1-C所示，在第5 d，T2显著高于CK、T1和 T3，后者无显著差异。在第10 d和15 d，3个处理组均显著高于CK，其中T2最高，分别比CK高19.60%和9.36%。在第20 d，T2的叶绿素b浓度最高为6.52 mg·g-1，T2显著高于CK、T1和 T3，比CK高9.70%。如图1-D所示，在第5 d，T2显著高于CK、T1和 T3，后者无显著差异。在第10 d ，3个处理组均显著高于CK，其中T2最高，比CK高25.87%。

  在第15 d，T1和 T2显著高于CK和T3，且分别比CK高16.36%和33.25%。在第20 d，T1和 T2显著高于CK和T3，分别比CK高4.13%和15.76%，但T3处理却显著低于CK，比CK低32.49%。

  2.2 不同浓度BS对葡萄叶片光合参数的影响

  如图2所示，CK、T1和T2葡萄叶片的Pn、Gs和Tr浓度均随着处理时间的增加而增加， Ci随着处理时间的增加而下降。如图2-A所示，随着处理时间的增加，T1和T2葡萄叶片的Pn增加，在第10 d、15 d和20 d时，T1显著高于CK和其他处理组，且在第20 d 时达最大值为4.37 µmol·m-2·s-1，比CK高69.79%，T2比CK高36.46%，T3比CK低81.13%。如图2-B所示，在不同处理下，葡萄叶片的Gs在0.021~0.055 mol·m-2·s-1之间变化。在第5 d，10 d、15 d和20 d时，T1均显著高于CK及其他处理组。且在第20 d 时达最大值为0.055 mol·m-2·s-1，比CK高43.54% ，T2比CK高18.39%，T3比CK低86.27%。如图2-C所示，在不同处理下，葡萄叶片的Ci在278.67~441.00 µmol·mol-1之间波动。在第5 d，10 d、15 d和20 d时，T1和T2均显著高于CK，而 T3均显著低于CK。在第15 d时，T1和T2分别比CK高24.61%和20.02%，T3比CK低19.91%。如图2-D所示，随着处理时间的增加，T1和T2葡萄叶片的Tr增加，在第5 d，10 d、15 d和20 d时，T1和T2显著高于CK，且T1在第20 d时达最大值为4.37 µmol·m-2·s-1，比CK高152.34%，T2比CK高104.98%，T3比CK低38.06%。

  2.3 不同浓度BS对葡萄叶片荧光参数的影响

  如图3-A所示，葡萄叶片CK、T1和T2的F0在第5 d、第10 d和第15 d呈上升趋势，在第15 d后缓慢下降，且T2均显著高于CK及其他处理，并在第15 d达最大值为585.67，比CK增加了20.76%。如图3-B所示，葡萄叶片的Fm呈先升后降的趋势。在不同时间段，T2均显著高于CK及其他处理，且在第15 d达最大值为3403，比CK增加了36.73%。T3在第5 d和第10 d均显著高于CK，在第15 d与CK无显著性差异，但在第20 d显著低于CK，且达到整个处理期的最低值为1959，比CK下降了20.35%。如图3-C所示，Fv/Fm是暗适应下PSⅡ最大光化学效率，反映PSⅡ反应中心最大光能转换效率。各处理组的Fv/Fm在0.74~0.83之间波动。在第10 d和15 d时，T2显著高于CK，在第20 d，T1和T2与CK之间无显著变化，但均显著高于T3。

  2.4 不同浓度BS对葡萄叶片抗氧化酶活性的影响

  由图4可知，葡萄叶片的CAT、POD和SOD的活性随着时间的增加，CK、T1和T2均呈上升趋势，而T3呈先升后降的趋势。在不同时期，T1和T2的CAT、POD、SOD活性均显著高于CK和T3。如图4-A所示，在第5 d，CAT的三个处理均显著高于CK，在第10 d，第15 d和第20 d，T1和T2的CAT显著高于CK和T3，T1最高，分别比CK高36.09%、37.11%和36.73%。在第20 d， T3显著低于CK，比CK低18.57%。如图4-B所示，在第5 d和第10 d，POD的三个处理均显著高于CK，在第15 d和第20 d，T1和T2的POD显著高于CK和T3，T1分别比CK高45.79%和35.77%，T2分别比CK高45.68%和24.52%。在第20 d， T3的POD显著低于CK，比CK低37.06%。如图4-C所示，在第5 d，SOD的三个处理均显著高于CK，在第10 d、第15 d和第20 d，T1和T2的SOD显著高于CK和T3，T1分别比CK高4.063%、46.34%和42.90%，T2分别比CK高32.29%、60.28%和35.23%。在第20 d，T3处理的SOD显著低于CK，比CK低33.33%。

  2.5 不同浓度BS对葡萄幼苗根系生长的影响

  由表1可知，T1和T2的葡萄幼苗根系活力较CK有显著的增加，增幅分别为73.73%和60.23%，促进根系对养分的吸收。T1和T2的总根长、总根尖数、总分支数和总交叉数较CK和T3均有显著的增加。所有处理的根表面积、根体积和根平均直径与CK无显著性差异。可以发现，T1和T2对葡萄幼苗的根系生长有显著的促进作用，虽然T3对其也有促进作用，但促进作用的效果明显不如T1与T2。

  2.6 不同浓度BS与葡萄幼苗各指标间主成分分析

  不同浓度BS处理，对葡萄幼苗22个指标的数据进行主成分分析（表2~4）。由表2可知，从22个主成分中提取特征值大于1的3个主成分，其累计贡献率达到100%，能够较好的反映数据的所有信息，因此对这3个主成分进行综合评价。由表3可以看出，第一主成分对22个变量指标的信息携带充分。将上述3个主成分的得分值代入综合评价函数，计算不同浓度BS处理的综合得分，综合指数的得分越高，说明该处理对葡萄幼苗的生理特性和根系生长越好。从表4可以看出，不同处理下葡萄幼苗的生理特性和根系生长不同，其得分大小排序依次为T2 > T1 > T3 > CK。由此可见，0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1 BS处理下，其综合得分较为接近，可见葡萄幼苗在低浓度0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1 BS处理下能很好的生长，且适应性较强。在1.0 mg·L-1 BS处理下综合评分为负值，可见水培条件下，1.0 mg·L-1 BS处理已经影响了葡萄幼苗的生长。

  3 讨论

  本试验中，随着处理时间的增加，0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1 BS处理的葡萄叶片叶绿素、叶绿素a和叶绿素b都显著高于CK，这可能是由于BS促进叶片生成吲哚乙酸，进而促进叶绿素合成。0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1 BS处理的葡萄叶片随着处理时间的增加，Pn、Gs和Tr逐渐升高，这可能是由于BS对叶绿素具有促进作用，从而使得葡萄叶片的光合作用逐渐增加，而Ci逐渐降低，这可能是由于非气孔因素导致的。0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1 BS处理的葡萄叶片的F0、Fm和Fv/Fm随着处理时间的增加而增加。但葡萄幼苗在1.0 mg·L-1 BS处理中出现叶绿素含量、光和参数和荧光参数下降的现象，有可能是因为菌剂的施用量过高，使幼苗光合作用受到抑制从而使叶绿素和荧光参数下降。

  本试验发现，添加0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1 BS在不同时期对葡萄幼苗的CAT、POD和SOD活性均有所提升，这是因为低浓度的BS对葡萄幼苗的营养生长有较大的促进作用，诱导葡萄幼苗自身系统抗性，使幼苗葡萄幼苗自身产生一系列抗氧化酶，提高自身的抗性和系统抗病性，从而提升自身免疫力。但1.0 mg·L-1 BS在前期对葡萄幼苗的CAT、POD和SOD活性有所提升，而在后期对该酶类产生抑制作用，导致其活性不断下降，这可能是因为浓度过高会与葡萄幼苗争夺养分和生长空间，这种竞争会阻止葡萄幼苗获得足够的养分和水分，致使葡萄幼苗生长受限，从而导致抗氧化酶活性下降。因此，适宜浓度的BS可以提高葡萄幼苗叶片中的抗氧化酶活性。

  本试验结果表明0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1 BS对葡萄幼苗的根系生长和根系活力均有显著的提高，这有可能是由于BS可以产生某些生物活性物质，如生长素、细胞分裂素、赤霉素等，促进根系生长，从而提高幼苗的抗逆性。而1.0 mg·L-1 BS对葡萄幼苗的根系生长有提升，但效果不明显，并且对根系活力有抑制作用。这可能是高浓度的BS会释放抗生素等抗菌物质，抑制根系正常菌群的生长，影响葡萄幼苗的根系发育、养分吸收和生理代谢，导致葡萄幼苗生长迟缓。

  4 结论

  综上所述，可以发现0.5 mg·L-1 BS对葡萄幼苗的效果最佳，其次是0.1 mg·L-1 BS，两者均促进了叶绿素含量的积累，提高光合作用和荧光参数，提高了抗氧化酶的活性，刺激抗氧化酶系统启动，并且促进地下生物量的积累，进而提升葡萄幼苗的根系活力和根系生长。进行主成分综合分析，可得得分大小排序依次为0.5 mg·L-1 BS，0.1 mg·L-1 BS，1.0 mg·L-1 BS。由此可知，0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1 BS菌剂均能更好的促进葡萄幼苗的生长。