制汁葡萄品种改良岗位

郭印山 林洪 姜长岳

 

  葡萄因为具有较高的营养及经济价值在世界范围内广泛栽培，但目前主栽葡萄品种抗病性普遍较差，严重影响了果实的品质与产量，对葡萄产业造成巨大损失，目前，主要的防治方法是化学防治，但这种方法增加经济成本的同时易造成环境污染和对人体健康造成潜在危害。所以抗病育种工作是改良和提高葡萄抗病性的根本措施。目前有关葡萄灰霉病抗性的调控机理研究仍不明确，因此，挖掘葡萄抗灰霉病关键基因，阐明葡萄抗病调控机理对指导葡萄抗病分子育种工作具有重要的现实意义。

  在葡萄抗病的过程中，转录因子发挥着至关重要的作用。本团队前期发现抗病品种‘贝达’葡萄中两个转录因子VlMYB74和VlWRKY48在灰霉菌接种诱导条件下具有显著高于感病葡萄品种‘红地球’的表达水平。本研究克隆和获得了VlWRKY48和VlMYB74基因，对其序列特征系统分析，通过实时荧光定量PCR明确VlWRKY48和VlMYB74在葡萄不同组织器官中的表达模式。利用烟草叶片进行亚细胞定位，分析其基本功能特征。最终研究结果可为利用分子辅助育种技术进行葡萄抗病品种的选育工作提供理论及实验依据。

  1 材料与方法

  1.1 植物材料

  ‘红地球’各组织器官（根，茎，叶片，卷须，花序，成熟期果实）均采自沈阳农业大学葡萄资源圃。本氏烟草（Nicotiana benthamiana）均保存于本实验室。

  1.2 主要试剂

  过氧化氢检测试剂盒购自苏州格瑞思生物科技有限公司，荧光定量PCR相关试剂购自诺唯赞生物科技有限公司。

  1.3 主要载体与菌种

  实验克隆载体：pLB-Simple vector（天根生化科技(北京)有限公司）

  植物表达及亚细胞定位载体：pCAMBIA2300-35S-GFP

  实验菌株：大肠杆菌菌株（DH5a）；农杆菌菌株（GV3101）

  1.4 本研究所用引物序列

  本研究所用引物通过Primer Premier 5.0软件设计（表1），经NCBI Primer Blast 检验后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，主要用于载体构建和表达 分析以及相关防卫基因的实时荧光定量PCR。

 

  1.5 方法

  1.5.1 葡萄组织器官的采集

  葡萄茎、叶、卷须、花序、成熟期果实等各组织器官采自多年生的美洲种与河岸杂交种葡萄（V. riparia×V. labrusca）‘贝达’、和欧洲葡萄（V. vinifera）‘红地球’，根取自于枝条水培苗，采集后液氮速冻，保存于超低温冰箱待用。

  1.5.2 RNA提取及实时荧光定量PCR

  葡萄各组织器官（包括叶片和果实）的总RNA提取方法参考试剂盒说明书操作步骤进行，内参基因为Actin，各试验均包含三次生物学重复。

  1.5.3 VlMYB74基因和VlWRKY48基因CDS序列的克隆

  （1）通过Primer 5设计特异性引物，详情见表1；

  （2）以2个葡萄品种 cDNA 为模板，同源克隆VlMYB74基因和VlWRKY48。基因扩增体系及PCR扩增反应程序如表2及表3所示；

  （3）凝胶电泳鉴定扩增后的PCR产物；

  （4）扩增后的正确片段利用Vazyme胶回收试剂盒进行回收，具体步骤参考试剂盒说明书；

  （5）将洗脱下来的DNA进行平端化，反应体系见表（3-4），反应液混合均匀，20℃，2min。然后70℃，5min。反应结束后置于冰上，然后连接到pLB Vector载体上，向平端化后的产物中加入1μL pLB Vector（35ng/μL）和1μL T4 DNA Ligase（35ng/μL），将反应液混合均匀，根据插入片段长度的不同，22℃连接5-30min；

  （6）连接完成后将10μL产物注入DH5a感受态细胞中，置于冰上30min后金属浴42℃热激45S，再置于冰上2min。将750μL无抗LB液体培养基加入离心管中，37℃摇床150rpm恒温活化1h，离心机5500 rpm离心2 min，留 80 μl左右 液体重悬菌体，涂布于氨苄青霉素终浓度100 mg/mL的LB固体培养基平板上，在37℃培养箱倒置培养15h，挑取单克隆菌落进行PCR扩增，筛选出阳性克隆的菌液送至生工生物公司测序；

  将测序结果对比到葡萄基因组网站以及NCBI上的VvMYB74和VvWRKY48序列，挑选测序正确的菌液，参照说明书使用质粒小提试剂盒进行质粒的提取（TIANGEN），最终得到包括VlMYB74以及VlWRKY48 CDS全长的重组pLB载体质粒，保存于-20℃低温冰箱。

  根据VlMYB74以及VlWRKY48的测序结果，NCBI Protein BLAST寻找VlMYB74以及VlWRKY48在不同植物中的同源基因，利用DNAMAN进行多重序列比对，利用MEGA构建系统发育树。

 

  1.5.4 载体构建

  以获得的VlMYB74 和VlWRKY48重组质粒为模板，依据表1的过表达载体设计引物，获得带有酶切位点的VlMYB74和VlWRKY48重组pLB质粒，接着对该质粒以及载体pCAMBIA2300质粒分别进行双酶切，酶切位点为BamHI和SalⅠ，设置程序37℃，30min。酶切是否成功通过跑胶判断，利用Vazyme胶回收-纯化试剂盒对目标载体和基因片段进行回收，连接的具体程序以及时间参考近岸蛋白NovoRec® plus One step PCR Cloning Kit试剂盒说明书，涂布于相应抗生素的LB固体培养基，再次对单克隆菌落挑点、菌落PCR后选取正确条带送测序，最终获得pCAMBIA2300-VlMYB74和pCAMBIA2300-VlWRKY48过表达载体质粒。

  2 结果与分析

  2.1 葡萄VlMYB74和VlWRKY48基因的克隆及生物信息学分析

  以抗病品种‘贝达’和感病品种‘红地球’的cDNA为模板，设计有特异性的VlMYB74和VlWRKY48基因克隆引物，利用同源克隆法，克隆得到 VlMYB74和VlWRKY48的CDS序列（图1）。结果显示，在2类不同抗性的葡萄品种，扩增到的WRKY48片段长度均在 500 bp与750 bp之间，扩增到的MYB74片段长度均在750bp与1000 bp之间。

 

  对VlWRKY48的序列进行分析，其包含一个543bp的开放阅读框（ORF），编码181个氨基酸（aa），预测其蛋白质相对分子量为14.98 kDa，等电点为10.57葡萄基因组网站显示VvWRKY48定位于葡萄6号染色体上，且包含一个完整的WRKY保守结构域（图2A）；利用DNAMAN软件，对VlWRKY48蛋白序列与葡萄基因组网站VvWRKY48蛋白序列进行比对（图2B）。结果表明，二者相似度达到95.24%，在保守结构域区外的非结构域区域，有9个氨基酸缺失，对蛋白序列没有明显影响。

 

  对VlMYB74的序列进行分析，其包含一个798bp的开放阅读框（ORF），编码266个氨基酸（aa），预测其蛋白质相对分子量为30.17kDa，等电点为5.78。葡萄基因组网站显示VlMYB74定位于葡萄10号染色体上，且包含两个完整的SANT保守结构域（图3A）；利用DNAMAN软件，对VlMYB74蛋白序列与葡萄基因组网站VlMYB74蛋白序列进行比对（图3B）。结果表明，二者相似度达到96.27%，仅有1个氨基酸发生突变，在保守结构域区域谷氨酸（E）突变为丙氨酸（A），对蛋白序列没有明显影响。另外在非结构域区域，有三个氨基酸的缺失以及六处氨基酸的突变发生，分别为丝氨酸（S）突变为脯氨酸（P），亮氨酸（L）突变为蛋氨酸（M），精氨酸（R）突变为甘氨酸（G），丙氨酸（A）突变为苏氨酸（T），天冬氨酸（D）突变为谷氨酸（E），亮氨酸（L）突变为丙苯氨酸（F）。

  

  为了明确葡萄VlWRKY48基因与其他物种同源基因之间的亲缘关系，利用NCBI Protein BLAST功能寻找VlWRKY48同源基因并进行了序列比对（图4A）及系统发育树的构建（图4B）。序列比对发现，VlWRKY48的同源基因同样具有完整的WRKY结构域，葡萄VlWRKY48与葡萄VrWRKY48亲缘关系较近且具有较高的序列相似性。此外，利用SWISSMODEL数据库（https://swissmodel.expasy.org/）对VlWRKY48蛋白质的三维结构进行了预测（图4C），表明其在进化过程中高度保守。

 

  2.2 葡萄VlMYB74和VlWRKY48的亚细胞定位分析

  为了研究VlMYB74和VlWRKY48的功能特征，对VlMYB74和VlWRKY48进行亚细胞定位试验，构建pCAMBIA2300-35s-GFP-VlMYB74和pCAMBIA2300-35s-GFP-VlWRKY48融合表达载体。将融合载体转化烟草叶片，pCAMBIA2300-35s-GFP空载体作为对照中，2d后，用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光信号。结果表明，VlMYB74和VlWRKY48定位于植物细胞核中，GFP空载体的荧光信号分布在细胞膜和细胞核中（图6）。

 

 

  2.3 葡萄MYB74和WRKY48的组织特异性表达

  为了明确MYB74和WRKY48在葡萄不同组织器官中的表达情况，选取了感灰霉病材料‘红地球’和抗灰霉病材料‘贝达’的根、茎、叶、卷须及成熟期果实进行组织特异性表达分析（图7）。结果表明，MYB74和WRKY48 在两种材料的各组织器官中均有表达。结果显示，在WRKY48中除了成熟叶，其他6个组织在‘贝达’中的表达量始终高于红地球，且在花序中表达量最高，是嫩叶表达量的26倍，在MYB74中所有组织在‘贝达’中的表达量始终高于‘红地球’，且在老叶中表达量最高，是嫩叶表达量的38倍。WRKY48和MYB74在各个组织中均有表达，由此可以看出这两个基因也参与了调控植物生长发育的过程（图8）。

 

 

  3 小结

  本研究利用抗灰霉病品种贝达作为主要供试材料，同源克隆了VlWRKY48和VlMYB74基因，对其序列特征进行了系统性的生物信息学分析，通过实时荧光定量PCR明确了VlWRKY48和VlMYB74在葡萄不同组织器官中的特异性表达模式。通过将融合过表达载体瞬转到烟草叶片中，进行了亚细胞定位分别分析了两个转录因子的基本特征。为后续开展VlWRKY48和VlMYB74的抗灰霉病调控机理研究提供理论及实验依据。