酿酒葡萄栽培岗位

房玉林 张克坤 李磊

 

  1 目的意义

  中国有很多栽培酿酒葡萄的产区，不同的产区有着气候和生态环境特点，而影响酿酒葡萄品质的因素很多，光照、温度、湿度和水分等以及土壤营养条件及土壤结构都对葡萄果实品质产生影响。光照是葡萄生长发育的必备条件，光照强度、日照长度、光谱成分的不同都会影响葡萄与葡萄酒的品质。良好的光照条件与浆果着色、品质、产量的形成等都密切相关。宁夏贺兰山东麓是宁夏回族自治区特别重视的特色生态经济产业区，该地区也是目前我国公认的最适合种植酿酒葡萄的优质产区之一，但是光照强度过高会导致葡萄提前成熟，表现为糖分过量或过快积累，还会产生葡萄果实酸度低、ｐＨ值高和非典型香气（如过 熟味、果 酱 味）的 产 生以及日灼的现象。因此，适当降低宁夏产区的光照强度可以提高葡萄与葡萄酒的品质。

  2 材料与方法

  2.1 材料

    

  供试品种为酿酒葡萄品种马瑟兰，位于宁夏贺兰山东麓美贺酒庄。

  2.2 试验设计   

 

  在贺兰山东麓美贺酒庄基地，对马瑟兰葡萄品种在叶幕两侧搭建遮阳网来减弱叶幕的光照强度，在马瑟兰葡萄开始进入转色期时进行六种遮阳网搭建处理：0.6m宽度白色遮阳网处理、1m宽度白色遮阳网处理、0.6m宽度红色遮阳网处理、1m宽度红色遮阳网处理、0.6m宽度黑色遮阳网处理、1m宽度黑色遮阳网处理。

 

  2.3 测定方法

  2.3.1 果实生长指标测定

  百粒重

  从每个果穗的上中下三个部位随机选取20个果粒，之后将所有果粒混合后选取100粒，在电子天平上称重，计算单粒重，并重复三次操作计算平均值。

  2.3.2 果实基本理化指标测定

  可溶性固形物：手持测糖仪测定。

  pH值：pH计测定。

  滴定酸：滴定法测定

  总糖（葡萄糖）：参考王华(1999)的方法测定

  有机酸：样品榨汁，5000g离心，-40℃保存备用。样品在实验室室温下融解，充分摇匀后吸取样1 mL，稀释5倍，用0.22μm微孔膜过滤，备用。采用 Waters1525高效液相色谱系统，采用DIKMA Platisil NH2（250x4.6mm, 5μm）色谱柱；流动相25mM的磷酸二氢钾（磷酸调pH至2.5），流速1.0 mL/min，柱温25℃，采用waters2998二极管阵列检测器，检测波长210 nm。

  （2）葡萄酒基本理化指标测定

  残糖(以葡萄糖计)、总酸(以酒石酸计)、pH值等；酒精度、挥发酸、硫、干浸出物用FTIR葡萄酒分析仪测定。

  2.3.3 葡萄果实与葡萄酒中酚类物质测定

  （1） 葡萄与葡萄酒中酚类物质各分类的总量测定

  葡萄果皮中的酚类物质的提取参考江雨(2016)的方法利用盐酸甲醇溶液进行提取，将提取液置于-20 ℃冰箱中保存备用。

  ① 总酚。葡萄果实与葡萄酒总酚含量使用福林-肖卡法进行测定，结果以没食子酸计。

  ② 总单宁。葡萄果皮与葡萄酒中单宁的测定采用甲基纤维素沉淀法(MCP法)进行，结果以儿茶素计。

  ③ 总花色苷。葡萄果皮与葡萄酒总花色苷含量参考刘金串等（2012）的方法利用pH示差法进行测定，结果以矢车菊素-3-葡萄糖苷等价值表示。

  ④ 总黄烷三醇。葡萄果皮中的总黄烷-3-醇采用 p-DMACA-盐酸法进行。结果以(+)-儿茶素计。

  ⑤ 总类黄酮。葡萄果实与葡萄酒总类黄酮的测定参照Ivanova等（2012）的方法进行，略有修改，结果以芦丁计。

  （2） 葡萄与葡萄酒中单体酚类物质测定

  ①葡萄皮与葡萄酒中花色苷物质的提取检测

  A. 果皮中花色苷提取检测方法如下：

  准确称取0.250 g(记录)葡萄皮干粉于50 mL 离心管，加入5 ml 提取剂，提取剂由甲醇:甲酸（V:V）（分析纯）为98:2 的比例配制而成，避光超声10 min（超声温度保持20 ℃，功率为100 W），25 ℃条件下避光摇床震荡30min（130 r/min），然后 8000 g 离心 10 min，用1 mL 移液枪转移上清液至对应50 mL 离心管，如此提取步骤重复4 次，合并上清液（累计20 mL左右）并在 30 ℃条件下减压旋转蒸发至干燥，剩余物质用定溶剂（定溶剂为液相检测室流动相A:B  体积比为9:1配制）（流动相A:甲酸:乙腈:水=2:6:92,流动相; B:甲酸:乙腈:水=2:54:44）定容为5 mL。样品于-80 ℃ 冰箱保存以备上机检测。每生物学重复取一次。

  花色苷物质检测采用Agilent 1100系列 LC/MSD Trap-VL液相色谱-离子阱质谱联用仪配有二极管阵列检测器（DAD）进行样品的定性和定量分析。流动相 A：甲酸：乙腈：水=2:6:92，流动相 B：甲酸：乙腈：水=2:54:44。流动相洗脱程序如下：1~18 min，10%~25% B；18~20 min，25% B；20~30 min，25%~40% B；30~35 min，40%~70% B；35~40 min，70% ~100% B。流动相的流速为 1.0 mL/min；柱温为50 ℃；检测波长为525 nm；波长扫描在200~900 nm；进样量为30 µL。质谱条件为：电喷雾离子源（ESI），正离子模式。离子扫描范围为100~1500 m/z；雾化器压力为35 psi；干燥气流速为12 L/min；干燥气温度为300 ℃。每个样品重复进样两次，做为2次技术重复。

  花色苷定量以二甲花翠素葡萄糖苷为外标物做标准曲线，检测出的花色苷类物质均以二甲花翠素葡萄糖苷的含量计，果皮中花色苷浓度单位用mg/kg（果实鲜重）表示。

  B. 葡萄酒花色苷酚类物质检测方法如下：

  取2 ml待测酒样，离心，经过0.45 µm的无机滤膜（聚醚砜）过滤，样品直接进行HPLC-MS分析。葡萄酒花色苷类物质的HPLC-MS检测方法同葡萄果实花色苷HPLC-MS检测方法。

  ②葡萄皮与葡萄酒中非花色苷酚类物质的提取检测

  A.果皮中非花色苷酚类物质的提取检测如下：

  准确称取1 g葡萄皮干粉于50 mL 离心管中，加入1 mL 蒸馏水和9 mL 乙酸乙酯(分析纯)，25 ℃ 条件下避光摇床震荡30 min(摇床转速 130 g)，8000 g 离心5 min，用1 mL 移液枪转移上清液于对应50 mL 离心管中，重复4次(上清液加黑色袋遮光)，合并上清液(累计40 mL左右)于旋转蒸发仪33℃蒸发至干，色谱甲醇定容至1 mL。

  实验采用 Agilent 1200 系列 LC/MSD 离子阱液相色谱-质谱联用仪，包括在线G1379A 真空溶剂脱气机、G13llA 四元高压梯度泵、G1313A 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1315A 二极管阵列检测器(DAD)。色谱柱采用反相 250 mm×4.6 mm，5 μm的Zorbax SB-C18柱(Agilent Technologies)，流动相 A：1.0% 的醋酸水溶液；流动相 B：1.0% 醋酸甲醇溶液；洗脱程序；0-15 min，10%-26% B；15-30min，26%-40% B；30-50 min，40%-65% B；50-60 min，65%-95% B；60-63 min，95%~10% B；63-66 min，10% B isocratic；流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样量：10 μL。MSD 参数：离子源为ESI，采用负离子模式；雾化气压力为 30 psi；干燥气流速为 10 mL/min；干燥气温度为325 ℃；离子扫描范围为100-1500 m/z。CID的MS/MS 诱导碰撞能量为1.0 V。

  配制8个浓度水平的混标，每个水平重复 3 次，以各组分的平均峰面积（Area）对浓度（Amt，mg/L）在工作站中建立标准曲线，通过标准曲线计算果皮(干重)中非花色苷酚含量，单位为 mg/g。

  B.葡萄酒中非花色苷酚类物质提取检测如下：

  取2 ml待测酒样，离心，经过 0.22 µm 有机滤膜（尼龙）过滤，然后进行HPLC-MS/MS分析。采用 Agilent1200 系列 LC/MSD Trap-VL 高效液相色谱-离子阱质谱联用仪对提取产物进行检测。流动相 A 为 10%（V:V）乙酸水溶液，流动相B为90%乙腈（V:V）和10%乙酸溶液，流动相洗脱梯度为：0~5 min, 5.0~8.0% B；5~7 min，8.0~12.0% B；7~12 min，12.0~18.0% B；12~17 min，18~22% B；17~19 min，22~35% B；19~21 min，35~100% B；21~25 min，100% B；25~27 min，100~5% B。流动相流速为 1.0 mL/min；柱温为 25℃；检测波长在 280 nm；进样量为2 µL；质谱采用电喷雾离子源（ESI），离子扫描范围：100-1000 m/z，负离子模式；雾化气压力为 35 psi；干燥气流速为 10 L/min；干燥气温度为 325℃；最大累计时间为 300 ms；Trap ICC：30000 units；CID 的 MS/MS 诱导碰撞能量为1.0 V。每个样品重复进样两次，做为 2 次技术重复。

  3 初步结果

 

 

  由表1可知：0.6m宽度白色遮阳网、0.6m红色和1m宽度红色遮阳网处理对葡萄果实百粒重有着提高作用，其中1m红色遮阳网处理提高效果最为显著，提高了3.94％。0.6m宽度红色遮阳网处理较对照组降低了pH值。除0.6m宽度的黑色遮阳网处理均较对照组降低了还原糖含量，其中1m宽度黑色遮阳网处理效果最为显著，降低了9.91％。同时六种遮阳网处理均较对照组降低了可溶性固形物含量。1m宽度的白色、红色、黑色遮阳网处理相较于对照组均提高了总酸的含量，其中1m宽度的白色遮阳网处理提高效果最为显著。提高了12.73％。

 

 

  如表2所示:果实二甲花翠素3-O-葡萄糖苷单体比例最高，其中0.6m红色遮阳网处理提高了二甲花翠素3-O-葡萄糖苷单体的含量，提高了10.65％，同时，0.6m宽度的遮阳网均比1m宽度遮阳网处理对二甲花翠素3-O-葡萄糖苷单体含量降低效果小。六种遮阳网处理均较对照组提高了二甲花翠素3-O-（6-O-反式对香豆酰）葡萄糖苷单体的含量，其中0.6m红色遮阳网处理提高效果最为显著，提高了53.35％。对于二甲花翠素3-O-葡萄糖苷单体的含量，0.6m红色遮阳网处理也较对照组提高了其含量，提高了10.65％。这三种物质在花色苷组分中占比达到83％以上，而0.6m宽度红色遮阳网处理均对这三种花色苷单体组分起到了提高作用。

  如图2所示：1m宽度的白色、红色、黑色遮阳网处理均相较于对照组降低了果实葡萄糖的含量，其中，1m宽度红色遮阳网对果实葡萄糖含量的降低最为显著，降低了3.08％，而0.5m宽度的三种遮阳网处理提高了果实葡萄糖的含量。

 

  如图3所示：1m宽度的白色、红色、黑色遮阳网处理均相较于对照组降低了果实果糖的含量，其中，1m宽度红色遮阳网对果实果糖含量的降低最为显著，降低了1.27％，而0.5m宽度的三种遮阳网处理提高了果实果糖的含量。

 

  由表三可知:0.6m宽度白色遮阳网处理相较于对照组提高了酒石酸得含量，提高了1.68％，六种遮阳网处理均较对照组提高了苹果酸的含量，其中0.6m宽度白色遮阳网处理提高效果最为显著，提高了13.72％，同时六种遮阳网处理均较对照组提高了柠檬酸的含量，其中0.6m宽度的黑色遮阳网处理提高效果最为显著，提高了39.66％。除1m宽度的红色遮阳网处理较对照组琥珀酸的含量略微降低，其他五种遮阳网处理均提高了琥珀酸的含量，其中1m宽度的黑色遮阳网处理效果最为显著，提高了93.29％。

 

 

  如图4所示：1m宽度的白色、黑色遮阳网处理均相较于对照组提高了总单宁的含量，其中，1m宽度白色遮阳网对果实果糖含量的提高最为显著，提高了41.02％；而0.6m宽度的白色遮阳网、黑色遮阳网处理对总单宁物质的降低较为显著。

 

 

  如图5所示：六个遮阳网处理组较对照组总酚物质含量均明显降低，其中0.6m宽度的白色、黑色遮阳网处理对总酚物质的降低最显著。

  

  如图6所示：六个遮阳网处理组较CK组总黄烷三醇物质含量均明显降低，其中0.6m宽度的黑色遮阳网处理对总黄烷三醇物质的降低最显著。

 

  如图7所示：六个遮阳网处理组较CK组总黄烷三醇物质含量均明显降低，其中0.6m宽度的黑色遮阳网处理对总类黄酮物质的降低最显著。

 

  4 结论

  （1）0.6m宽度的红色遮阳网处理对花色苷组分的含量有着明显的提高作用。

  （2）1m宽度的三种遮阳网处理均对葡萄果实的葡萄糖、果糖起到了降低作用，而0.6m宽度的遮阳网处理起到了提高作用，表明强光对葡萄果实的光合有着抑制作用，0.6m宽度的遮阳网处理降低了此抑制效果。

  （3）六种遮阳网处理均对果实的柠檬酸、苹果酸、琥珀酸起到了提高作用，而对于葡萄果实特有的酒石酸只有0.6m宽度的白色遮阳网处理起到了提高作用。

  5 尚需进行的工作

  尚需要对不同遮阳网处理对酚类物质组分的影响，以及对挥发性香气物质的影响，需要进一步的探究。