生态与土壤管理岗位

杜远鹏 王信东 高振 孙庆华 杨全刚

  摘要：葡萄是世界上最重要的经济作物之一，土壤盐碱化会制约葡萄的生长发育，限制其产量。根际微生物会影响植物的生长发育，有助于植物抵抗土壤盐碱化等非生物胁迫。微生物改良具有成本低、无污染等优点，其与生物炭联合使用是改良盐碱土的一种很有前途的方法。本研究从潍坊滨海根际土分离到两株耐盐且产胞外多糖的细菌，分别为枯草芽孢杆菌和食树脂假单胞菌。分析了接种微生物菌剂和生物炭对盐碱地葡萄园土壤理化性质的影响。结果表明有益微生物菌剂和生物炭促进了改良了土壤理化性质。研究结果为微生物改良土壤盐碱化提供了指导。

  葡萄在世界范围内被广泛种植，然而不利的气候条件以及耕作导致土壤盐碱化逐渐加剧，严重影响了葡萄的正常生长发育。盐碱地土壤的物理化学性质都很差。从物理特性上看，团聚体崩解、颗粒团聚体分散、孔隙率减小，导致容重增大、通气不良。从化学特性上看，碱离子增多、pH值增高、微生物的活性降低，从而导致了土壤的肥力下降。因此盐碱地改良成为了目前急需解决的问题。

  微生物改良低成本，对环境友好且持续改良效果强，在盐碱地改良中有极高的推广价值。它通过微生物的新陈代谢活动促进植株对养分的吸收，增加土壤有益微生物的种类及数量，使土壤中的难溶性营养物质转变成可被植物吸收和利用的有效营养物质，进而改善植物的生长和抗逆性。微生物的生命活动会像外界分泌一种水溶性多糖，统称胞外多糖（Exopolysaccharides, ESP）。胞外多糖作为一类天然的物质，较于外源糖类，不仅有良好的环境适应力且安全性高，无副作用，由于其独特的结构及丰富的分子内活性基团，因此也可增强植株的抗逆性，改良土壤（Rossi et al, 2012），在农业领域有着广阔的应用前景。

  1 材料与方法

  1.1 试材及处理

  供试土壤采集于潍坊滨海植株根际盐碱土，采集样品时应注意去掉土壤中的植株残茬及杂质，以免对供试土壤样品造成影响。采样时间为2022年11月，将采集到的土壤样本装入无菌袋中，封口，于4℃冰箱保存。用于产胞外多糖微生物筛选。

  盆栽试验于2023年3-4月在山东农业大学园艺试验站日光温室（山东泰安，东经117.6°，北纬36.17°）进行，以‘阳光玫瑰’扦插苗为试验材料，每盆每五天浇灌0.42%盐碱溶液（NaCl:Na2SO4:NaHCO3=4:5:5）400 mL，试验周期为30 d，共设置6个处理：（1）、CK：400 mL稀释100倍的发酵液（2）、T：80 g生物炭+400 mL稀释100倍的发酵液（3）、B4：400 mL稀释100倍的枯草芽孢杆菌菌剂（4）、TB4：80 g生物炭+400 mL稀释100倍的枯草芽孢杆菌菌剂（5）、B9：400 mL稀释100倍的食树脂假单胞菌菌剂（6）、TB9：80 g生物炭+400 mL稀释100倍的食树脂假单胞菌菌剂，菌剂OD600=0.5。处理开始时施加处理，之后每隔10天浇灌一次菌剂，共处理2次，每个处理设置6个重复。

大田试验于2023年4-10月在潍坊市寒亭区山东京琪农业科技有限公司进行，以三年生‘阳光玫瑰’为试材，试验共设置6个处理（1）、CK：10 L稀释100倍的发酵液（2）、T：1.5 kg生物炭+10 L稀释100倍的发酵液（3）、B4：10 L稀释100倍的枯草芽孢杆菌菌剂（4）、TB4：1.5 kg生物炭+10 L稀释100倍的枯草芽孢杆菌菌剂（5）、B9：10 L稀释100倍的食树脂假单胞菌菌剂（6）、TB9：1.5 kg生物炭+10 L稀释100倍的食树脂假单胞菌菌剂，菌剂OD600=0.5。采用沟施和根灌的施肥方式，在距葡萄植株30cm生根处，开深度30-40cm沟，将生物炭沟施菌剂根灌后覆土，4月施加第一次处理，之后每隔1个月施加一次，共处理5次，每个处理重复6次。

  1.2 方法

  1.2.1 产胞外多糖微生物的筛选、功能测定、发酵条件优化及分类

  采用稀释涂布法筛选各差异菌株。将筛选的差异菌株通过苯酚-硫酸法测定胞外多糖的产量，通过解磷培养基和解钾培养基上光圈大小测定菌株解磷解钾能力，选取两个优势菌株进行后续试验。

  以2%的葡萄糖和蔗糖作为供试碳源，0.5%的胰蛋白胨、酵母粉、硫酸铵为供试氮源，0.1%的NaCl、MgSO4、KH2PO4为供试无机盐进行试验，同时将该菌株的发酵液80℃水浴15 min，采用稀涂布法计算芽孢形成量。

  选择最优碳源、最优氮源以及最优无机盐采用三因素三水平L9（33）进行正交试验，通过极差分析找出最佳配比。

  新鲜培养的菌株发酵液（OD600=0.8）离心，无菌水洗涤3遍后重悬，将洗涤好的菌体接种至最佳配比的培养基中，37℃、200 r min-1的培养条件下振荡培养84 h，每12 h测定各发酵液的OD600值，绘制菌株生长曲线。

  菌株送至擎科生物（青岛）有限公司对其测序，筛选同源性较高的16S rRNA序列，利用用MEGA7软件邻近法，构建菌株系统发育树，并对其进行分类，确定种类。

  1.2.2 土壤理化指标的测定

  pH计测定土壤pH，电导率仪测定土壤EC值，质量差法测定土壤水溶性盐含量，碳酸氢钠浸提－钼锑钪比色法测定速效磷，乙酸铵浸提－火焰光度法测定速效钾。湿筛法测定土壤团粒结构。环刀法测定土壤容重。

  1.3 数据处理

  用Microsoft Excel 2019进行处理数据，用Origin2021进行作图，用SPSS 21.0软件对数据进行单因素方差分析及多重比较，用LSD法进行差异显著性检验，显著水平P＜0.05。数据以平均值±标准差表示。

  2 结果与分析

  2.1 菌株的分离功能测定及培养基优化

  通过苯胺蓝高盐培养基分离出13株产胞外多糖的菌株（图1 A）。在37℃LB液体培养基和高盐LB液体培养基中培养48h后，发现B4、B9菌株在LB液体培养基中产糖量最高（图1 B），在高盐LB液体培养基中B4产糖量最高，B9次之（图1 C）。划线涂板后发现两菌株均呈现边缘圆润光滑的菌落（图S1 A,B）。通过解磷培养基和解钾培养基上的光圈大小可知B4解磷比值为1.97，B9解磷比值为2.98（图S2 A,B）；B4解钾比值为1.25，B9解钾比值为2.00（图S3 A,B），B9菌株解磷解钾能力显著高于B4菌株。16S rDNA测序显示，B4为枯草芽孢杆菌（图1 D），B9为食树脂假单胞菌（图1 E）。菌株B4（CGMCC NO.29234）和B9（CGMCC NO.29235）送至中国普通微生物菌种保藏管理中心保存。

  对筛选的两菌株进行发酵条件优化发现，两菌株的最优碳源均为蔗糖，最优氮源均为胰蛋白胨，最优无机盐B4为MgSO4，B9为KH2PO4。通过L9（33）正交试验发现B4的最优培养基配比为/L 25 g蔗糖+6.5 g胰蛋白胨+1 g MgSO4，B9的最优培养基配比为/L 25 g蔗糖+6.5 g胰蛋白胨+1 g KH2PO4。在最优培养条件下进行菌株生长测定，B4菌株在48 h生长达到峰值，B9菌株在60 h生长达到峰值。

  2.2 枯草芽孢杆菌、食树脂假单胞菌和生物炭对土壤理化性质的影响

  施用B4、B9菌剂和生物炭均不同程度上降低了土壤pH、EC值和含盐量，其中T和TB9处理的土壤pH值降低达显著水平，相较CK分别降低了0.04、0.05（图2 A）。T、TB4、TB9三个处理的土壤EC值降低达显著水平，相较CK分别降低了11.08%、11.10%、10.55%，其余两组B4和B9处理土壤EC值也有所降低，分别为5.99%、5.62%（图2 B）。各处理土壤含盐量相较于CK分别降低了9.26%、9.26%、13.62%、27.25%、40.87%，其中TB9处理对降低土壤含盐量效果最为显著（图2 C）。综上所述TB9菌剂和生物炭配施对降低土壤pH、土壤EC值和含盐量作用最显著。

  土壤速效磷、速效钾较CK各处理均有显著增加，TB9提高效果最为显著，分别为21.93%、15.91%（图2 D,E）。土壤容重以TB9效果最显著，降幅为15.20%（图2 F），这说明微生物在土壤中的活动具有改善土壤物理性质的作用，提高了土壤疏松透气度（Han et al., 2013），进而降低土壤容重。＞0.25 mm的土壤团聚体具有良好结构，可以起到疏松土壤、促进植株吸收水分和营养的作用，MWD和GMD能够较好地反映土壤团聚体在不同尺度上的分布状态，其数值越大，表明土壤团聚体的平均粒径团聚度越高，其稳定性越好。添加B9菌剂和生物炭的TB9处理显著提高了土壤R0.25、MWD和GMD（图2 G,H,I）。

  5 结论

  从盐碱土中筛选出两株具有较强的耐盐性及产胞外多糖能力的枯草芽孢杆菌及食树脂假单胞菌，本试验探究了添加生物炭作为土壤改良剂与两种菌剂混施对土壤环境的影响。