酿酒葡萄品种改良岗位

  摘要：单宁被认为是葡萄的特征性代谢物，具有丰富的药理功效，深入系统地开展对葡萄单宁的研究对于单宁资源的获取和创新利用具有重要意义。采用Folin-Ciocalteu和Folin-Denis法分别对‘黑比诺’和‘马瑟兰’及其杂交F1子代100个单株果实各部位总单宁，总酚含量进行分析，探讨了单宁及其单体在葡萄中的遗传趋。结果表明，葡萄果实各部位总酚的变异系数范围为23.16%-74.76%，总单宁的变异系数范围为23.18%-45.09%。

  葡萄是世界上最受欢迎的水果之一，葡萄产业一直是我国重点关注和发展的产业之一。葡萄不仅可鲜食，制干，还可以制酒等，并且因为其富含的营养价值和药用价值收到了消费者的热爱。我国酿酒葡萄种质资源丰富，但是对在酿酒葡萄的研究主要集中在田间栽培管理和传统栽培葡萄品种果实的营养组分上，而对丰富的葡萄种质果实内含物，包括单宁尚缺少系统性的研究报道，导致葡萄种质资源开发利用不足，使得酿酒葡萄新品种的培育及推广常常落后于需求。本研究以100份葡萄杂交后代果实为试验材料，利用液相质谱技术测定葡萄果实总酚、总单宁和其各单体含量，分析其遗传趋势，为之后葡萄单宁合成通路解析提供参考，同时为育种者在育种亲本选择方面提供理论数据。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  黑比诺与马瑟兰组合于2015年杂交获得种子，经过层积等处理于2016栽培于山西省农业科学院果树研究所葡萄育种园，株行距为0.5 m×2.5 m，常规管理。于2019年9月开始对完全成熟的亲本及后代进行采样，通过冰盒带回实验室，利用液氮速冻100 g果实于超低温冰箱中，用于单宁类物质的测定。

  1.2 试验方法

  （1）果实不同部位单宁提取液的制备

  对从超低温取出的葡萄果实进行果皮、果肉、种子的分离，用滤纸将果皮和种子上的汁液吸收干净后分别取2 g果皮、2 g果肉、2 g种子进行冷冻研磨，称取1 g研磨后的样品于50 mL离心管中，以80%（体积分数）的甲醇作为提取溶剂，料液比为1:20，超声提取30 min，室温下摇床振荡浸提11 h，提取完成后离心（4000r/min，10min），收集上清液，并使用0.22 μm滤膜进行液相质谱分析。

  （2）果实不同部位总酚及总单宁物质测定

  采用Folin-Ciocalteu法测定果实不同部位的总酚含量；采用 Folin-Denis 法测定果实不同部位的单宁含量；

  1.3 果实不同部位单宁各单体物质测定

  （1）仪器与试剂

  液相-质谱联用仪（UHPLC-MS/MS，Aglient 6495）；Infintylab Poroshell 120 CS-C18色谱柱（3.0100mm，2.7 μm），标准品儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、没食子儿茶素（GC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）（UV检测，纯度≥98%）、均购自 Solarbio。所用乙腈、甲醇及甲酸均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。

  （2）溶液制备

  取儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸脂的标准品各20 mg，置同一10 mL量瓶中，用80%甲醇溶解，作为对照品溶液；供试品溶液为上述单宁提取液。临用时将对照品溶液和供试品溶液均用0.22 μm微孔滤膜过滤，各精密吸取滤液10 μL进样。

  （3）色谱条件

  液相色谱条件：采用 Infintylab Poroshell 120 CS-C18（3.0100 mm，2.7 μm）色谱柱，流动相A：0.2%甲酸，含5 mm甲酸铵水溶液，流动相B：0.1%甲酸，50%甲醇，50%乙腈。梯度洗脱（0 min，1%B；1 min，1%B；8 min，20%B；16 min，40%B；25 min，40%B；26 min，99%B；；30 min，99%B；post time 3 min），流速0.4 mL·min-1，柱温40℃，进样体积10 μL。

  质谱条件：干燥气温度：200℃，干燥气流速：16 L/min，鞘气温度：360℃，鞘气流速：12 L/min，雾化器压力：45 psi，毛细管电压：3500 V（+）、3000 V（-），喷嘴电压：1500 V（+）、1000 V（-）；扫描模式：Dynamic MRM。

  1.4 统计分析

  采用利用Excel 2016，GraphPad Prism 8软件进行数据分析及表的制作。

  变异系数、遗传传递力和优势率等的计算公式如下：

  变异系数CV=S/F×100%；

  优势率Ha=（F–MP/MP×100%）；

  组合传递力（遗传传递力）Ta=F/MP×100%。

  S：标准差，Y：子代平均值，F：F1代平均值，MP：亲本平均值（亲中值）。

  2 结果与分析

  2.1 F1代葡萄果实不同部位单宁及总酚物质含量遗传变异分析

  黑比诺与马瑟兰的100个杂交后代成熟果实不同部位单宁及总酚遗传变异如表1，果肉中单宁和总酚含量的变异系数分别为74.76%和28.97%，后代呈较广泛分离。且表现为超高亲遗传，另外果肉中单宁及总酚含量的优势率均为正值。单宁和总酚在果实皮，肉籽中的组合传递力为81.64%~160.68%，呈连续分布。其中单宁在果皮和种籽中均表现为较高的超低亲遗传，这与总酚的表现保持一致。

  2.2 F1代葡萄果实不同部位不同单宁单体物质含量遗传变异分析

  F1代葡萄果实果肉中不同单宁单体的遗传变异如表2，儿茶素等7种单宁单体在F1代葡萄果实果肉中的组合传递力为46.65%～472.33%，呈现连续分布。且除GC外其他物质的变异系数均较大，后代呈较广泛分离。F1 代果肉中C，EC和GCG的优势率为正值，且超高亲率分别为23.00%、83.00%和78.00%，表现出一定的强亲优势。

  F1代葡萄果实果皮中不同单宁单体的遗传变异如表3，儿茶素等7种单宁单体在F1代葡萄果实果皮中的组合传递力为53.51%～168.7%，呈现连续分布。且7种单体的变异系数均较大，后代呈较广泛分离，其中EC含量变异系数最大，呈3倍变异。F1代果皮中GC和GCG的优势率较高，并分别表现为超高亲和超低亲遗传，C，EC和ECG超低亲遗传率为91.00%，69.00%和85.00%，而EC和GCG的超高亲遗传率为83%和78%，表现出一定的强亲优势。7种单体的组合传递率为53.51%~168.70%，呈现连续性分布。

  F1代葡萄果实种籽中不同单宁单体的遗传变异如表4，儿茶素等7种单宁单体在F1代葡萄果实种籽中的组合传递力为62.07%～576.56%，呈现连续分布。GC，EGC，GCG和EGCG的优势率为正值，这与果皮中的单体遗传趋势保持一致，其中GCG在F1代果实种籽中遗传优势率最高，变异系数最高且超高亲率为74.00%，表现出一定的强亲优势。

  3 讨论

  酿酒葡萄因其富含的酚类物质对人体的新陈代谢具有正向的调节作用，尤其是心血管方面，而深受消费者的喜欢。其中花色苷和单宁是酿酒葡萄中含量最为丰富的酚类物质。前者与葡萄酒的颜色密切相关，而单宁的含量则决定了葡萄酒的口感结构。另外单宁占西方饮食中摄入的类黄酮总量的主要部分。而红酒是黄酮类化合物的丰富来源，尤其是黄烷醇，其中包括其单体以及低聚和聚合单宁。本研究首先分析了葡萄果实不同部位中总酚和总单宁的含量，总的看葡萄果实三个部位中总酚含量皆高于总单宁含量，并且种籽中总酚和总单宁含量最高。Mattivi等人通过对不同葡萄品种的皮和种子提取物进行定量分析，精确定量出多达八种单体（儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯），且研究表明葡萄籽提取物主要含有三种单体（儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯）。葡萄皮提取物主要含有四种单体（儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素和表没食子儿茶素）。这一结果与研究结果一致，此外本研究结果显示在果肉中主要含有的单宁单体物质为C 和EC。通过对黑比诺与马瑟兰杂交后代果实不同部位不同单宁单体的比较，能够反映后代单宁单体的遗传规律。结果显示在杂交后代中葡萄果实不同部位的单宁单体含量不同，黑比诺与马瑟兰杂交后代中存在种子中各个单体物质含量分别高于双亲数倍的后代。在本研究中不同部位及不同单体物质的变异系数存在很大差异，在果肉中GCG变异程度较小，但其在种籽中变异程度较高。果肉和果皮中其他各个单体的变异程度均较高，而在种籽中其他单体物质的变异系数均较小，这说明果皮和果肉的选择潜力较大，而在种籽中单宁的遗传特性较为稳定。在黑比诺与马瑟兰F1代果皮和种子中各个单宁单体含量呈广泛分离，其变异主要来自遗传。GC和EGC主要存在于果皮中，而C、EC和ECG在F1代果皮中的含量有低于双亲的趋势，表现为减性遗传。

  研究利用液相质谱技术对100份杂交后代葡萄果实不同部位的总酚、总单宁以及单宁单体含量进行测定分析，研究表明葡萄果实中总酚含量显著高于总单宁含量，葡萄果实不同部位及不同单体物质的含量存在很大差异，变异系数均有所不同，且遗传规律不同，表明在葡萄果实中单宁物质的合成受到多基因调控。