酿酒微生物岗位

宋育阳 陆瑶 吴依然 刘延琳

  酿酒过程涉及将葡萄汁中的糖分转化为酒精的发酵过程，酿酒酵母在其中扮演核心角色（姜忠富等 2017）。然而，在某些特殊年份，葡萄积累过高糖分，导致初始发酵液糖浓度极高，给酵母的发酵代谢带来严峻挑战。高糖环境常引起酵母发酵停滞或进展缓慢，影响酒精完全发酵和最终酒质，这一问题已成为葡萄酒酿造业亟待解决的难题。近年来，随着分子生物学和代谢工程等技术的迅速发展，人们对酵母在高糖条件下如何应对胁迫、维持发酵活力的分子机制有了更多认识。越来越多的研究关注于通过优化酿酒工艺条件、筛选或者改造优良的高糖耐受酵母菌株等途径来应对发酵停滞。

  1 高糖发酵停滞的主要原因

  高糖环境对酵母代谢和生长造成的威胁并非单一因素，而是多种不利因素的综合作用（Ali et al. 2024）。根据现有研究，主要原因可概括为以下几个方面。

  1.1 渗透压胁迫

  发酵介质中葡萄糖或果糖等可溶性固体含量过高会导致渗透压急剧升高。高渗透压环境破坏细胞内外水分子和离子平衡，影响正常物质转运、酶促反应等，进而抑制细胞生长代谢（邓佳顺等 2023）。研究发现，当葡萄糖浓度从 20%升高到 40%时，酵母细胞生物量和发酵速率显著下降（徐颖超 2020）。除直接影响代谢，高渗透压还会引发一系列级联反应，如氧化应激、基因表达谱改变、细胞凋亡等，加剧发酵停滞。

  1.2 乙醇毒性

  发酵过程中，酵母不断产生并积累乙醇（郜希璐 2009）。当浓度超过一定阈值，乙醇即会对酵母产生毒性作用，主要表现为；（1）损伤细胞膜和细胞壁完整性，影响细胞内外物质交换；（2）引起蛋白质不可逆变性；（3）破坏还原环境，导致氧化应激；（4）影响 DNA 和 RNA 的合成和功能等。研究表明，乙醇浓度超过 8%时，酵母生长和发酵活性会受到严重抑制（孜力汗 2013）。虽然在高糖发酵时，由于渗透压影响，乙醇最终浓度较低，但长时间作用下仍会对细胞产生不可逆损伤，加剧发酵停滞。

  1.3 其他代谢压力

  除渗透压和乙醇毒性外，高糖还可能引发氧化应激、热休克反应、离子毒性等胁迫，进一步影响酵母生长发酵。例如，在糖浓度高达 28%时，酵母内源性还原力下降，细胞内累积大量活性氧簇，造成严重氧化损伤。高糖发酵温度升高，蛋白质热损伤加剧，酵母难以维持有序代谢。此外，底物中盐分等离子在高糖时也可能引发离子毒性。上述种种不利因素的叠加效应，导致酵母发酵代谢遭受多方位干扰，从而诱发发酵停滞现象的发生。

  2 酵母应对高糖胁迫的分子机制

  为了应对高糖环境带来的渗透压、乙醇毒性和氧化应激等各种胁迫，酵母进化出了一系列复杂而精细的分子调节机制（Na et al. 2022）。

  2.1 溶质积累调节

  在渗透压胁迫下，酵母通过合成和积累小分子有机溶质来提高细胞内渗透压，减小与外界环境的渗透压差（阮海华等 2006）。常见的有机溶质包括甘油、糖醇和离子等。

  其中，甘油是酵母最主要的渗透保护剂。当环境渗透压升高时，导致 HOG（高浓度渗透压反应基因）通路被激活，上调一系列合成甘油的关键酶（如 GPDI 和 GPRI 等），从而积累高浓度甘油，有效维持细胞渗透压与外界平衡，避免细胞脱水而死亡（曲艺2018）。研究发现，在 30%葡萄糖浓度下，耐受型酵母菌株内部甘油浓度可高达 100-150 mM，而敏感菌株仅 24 mM，这说明甘油积累量的高低在很大程度上决定了菌株的耐糖发酵能力（毕新煜等 2017）。

  除甘油外，三醇类化合物如甘露糖醇等，也是酵母在高渗透压下的重要保护溶质。最近研究还发现，一些离子（如 K+和 Cl-等）在胁迫条件下也可能参与渗透压调控（MAet al. 2023）

  2.2 细胞壁与质膜适应性变化

  细胞壁和质膜是酵母与外界环境接触的防线，其结构和组成的调节对应对高糖胁迫至关重要。

  在高糖条件下，酵母会通过改变细胞壁的组分和交联方式来提高其机械强度，增强渗透压耐受性，如细胞壁增厚、内酯含量升高、糖蛋白和烷基化程度提高等。此外，细胞壁也是抵御乙醇毒性的重要场所（张明明 2017）。

  质膜则主要通过改变脂肪酸构型（正/反式）、饱和程度和渗透蛋白通道的调控来提高对渗透压和乙醇的抵御能力。研究发现，一些耐受型酵母菌株在发酵时会增加质膜中不饱和脂肪酸的比例，提高其流动性，从而更好地耐受乙醇胁迫（Zhijun et al. 2022）。

  2.3 高糖应激下的保护蛋白

  在高糖等胁迫条件下，细胞内常会发生大量蛋白质的误折叠现象，从而失去生物活性。为防止这种损伤，酵母可以表达一系列分子伴侣/保护蛋白，主要包括热休克蛋白（Hsps）、小分子热诱导蛋白（sHsps）和丙氨酸异构酶/环化蛋白等。它们能够帮助识别和修复错误折叠的蛋白，维持细胞内正常的蛋白质同源性（homeostasis）。研究发现，过表达 Hsp104 和 Hsp12 会显著提高酵母在高糖条件下的耐受力（Xiaolan et al. 2022）。

  2.4 有机酸和次级代谢产物的调节作用

  在应对高糖胁迫的过程中，酵母还可能大量积累一些有机酸和次级代谢中间产物，这些物质或许参与了部分应激机制的调节。比如，乙酸和乳酸在高糖条件下的积累量会明显提高，有研究认为它们可能有助于维持细胞内外的 pH 和离子平衡，提高耐乙醇能力。另有研究发现，高糖时酵母产生大量α-酮戊二酸，有助于清除自由基，防止氧化损伤（Huxuan et al. 2024）。总的来说，这些有机酸或次级代谢产物的作用机理还不是很清晰，值得进一步探索。它们可能是酵母应对高糖环境的复杂调节网络中的一些关键节点（王晓丹等 2020）。

  2.5 转录因子与全局基因表达调控

  酵母对高糖的应对反应绝非单一的生化过程，而是一个涉及全基因组表达重编程的复杂生物学事件。

  先导这一过程的是一系列转录因子与信号转导通路。HOG 途径中的 Hog1、Msn2/4、Sko1 等转录因子在高渗透压下被激活，上调大量与糖代谢、离子转运、细胞壁合成等途径有关的基因。酵母在高糖条件下，还会高度诱导乙醇诱导转录因子如 Haa1、cyc8-tup1复合物等，启动耐乙醇基因表达程序。Oxr1、Yap1 等则是主要的氧化应激应答转录因子。此外，热休克因子 Hsf1、通用应激因子 Msn2/4、细胞周期调控因子 Yak1 等，都在高糖应激反应中扮演着不同角色。

  这些变化对代谢途径和发酵效率的影响。代谢途径的重定向：基因表达的变化可以导致代谢流向更有利的生产乙醇或其他代谢产物的方向重定向。发酵速率的调节：通过调控关键酶的表达，如丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，可以调节酒精发酵的速率（韩宗元等 2018）。副产物形成的抑制：通过精细调控代谢途径中的基因表达，可以减少不需要的副产物的形成，提高发酵过程的经济性。耐受性的提高：高糖环境下，酵母细胞通过上调应激响应基因来提高对渗透压和氧化应激的耐受性。生物合成能力的增强：在高糖条件下，通过调节核糖体生物合成和能量代谢相关基因的表达，可以增强细胞的生物合成能力。细胞周期的调控：高糖环境还会影响细胞周期相关基因的表达，进而影响酵母细胞的生长和分裂（郑祖亮等 2015）。