育种方法与技术岗位

 

  葡萄常规的遗传转化体系需较长时间且效率低，瞬时转化表达系统相比较稳定遗传转化系统具有简单、便捷、实验周期短等优势，表达时间一般维持在一周左右，适用于不易再生的植物研究。因此本方法以葡萄组培苗为材料，利用根癌农杆菌介导建立葡萄整株瞬时转化技术，为后续葡萄基因功能研究奠定基础，具体方法如下：

  1、试验材料与试剂。

  （1）挑选生长健壮且生长势较一致的5周苗龄的无核白组培苗为试验材料；该实验使用的根癌农杆菌菌株为GV3101，植物载体为pHB；实验中主要用的药品包括LB培养基、硫酸卡那霉素、利福平、MES、氯化镁、乙酰丁香酮、SilwetL-77等。

  2、实验步骤。

  （1）农杆菌活化：使用LB固体抗性培养基（含卡那霉素、利福平）进行菌株划线，于28℃培养箱中倒置培养16 h-20 h；随后挑取单克隆于500 μl LB液体抗性培养基中，于28℃摇床中培养12 h左右，转速为200 rpm；初次活化后，吸取100 μl菌液接入200 ml LB液体抗性培养基中，于28℃摇床中培养12-16 h左右至OD600 0.8-1.0。

  （2）农杆菌收集及侵染菌液制备：将菌液置于50 ml离心管中，6000 rpm离心10 min，弃上清。MES缓冲液（10 mM MES，10 mM MgCl2，100 μM乙酰丁香酮）调整菌液OD600至0.5，根据最终菌液体积按照4：1添加SilwetL-77，随后菌液于避光条件下静置2-3 h。

  （3）幼苗准备：挑选生长健壮且生长势较一致的5周苗龄组培苗（图A），将其从培养基中取出后，修剪茎底部叶片（图B）。

  （4）根癌农杆菌介导的瞬时转化：葡萄叶片的蜡质层较厚，因此需要采用真空渗透的方法对葡萄组培苗进行瞬时转化。将葡萄组培苗倒置于玻璃瓶中，将重悬的农杆菌菌液浸没植株，真空-0.1 Mpa，渗透10 min，重复2次，期间可观察葡萄叶片是否呈现半透明状。

  （5）侵染植株培养：将农杆菌真空渗透侵染的葡萄植株栽培于土壤中，用竹签固定根上部（图C），使用塑料瓶倒扣组培苗维持植株高湿环境（图D），置于室温条件下弱光共培养4天后，进行取样并开展后续实验。

  （6）转化植株qPCR阳性验证：采用CTAB法提取葡萄叶片RNA，利用DNase I消化RNA中残留的DNA，随即将RNA反转录成cDNA。以稀释20倍的cDNA为模板进行qPCR验证（图E，将侵染了pHB空载的植株作为对照）。

  （7）转化植株的非生物胁迫处理（盐胁迫处理）：配置200 mM NaCl溶液对植株进行胁迫处理，置于温度25℃、光照时间16 h/d的环境中培养，观察并记录胁迫情况（图F）。