酿酒葡萄品种改良岗位

  摘要：尿苷二磷酸糖基转移酶(UGTs)参与糖基化修饰过程，在植物生长发育、次生代谢和逆境响应中发挥重要作用。本文对葡萄UGT家族进行了系统的全基因组表达分析，以探讨其在葡萄中的重要功能。对VvUGT基因的顺式作用元件分析表明，这些基因在植物发育和对各种胁迫的响应中具有潜在的作用。此外，通过KEGG和GO富集分析筛选了与次生代谢过程相关的基因。表达结果显示，VvUGT基因在不同组织、果实发育阶段以及不同胁迫下的表达模式不同。这些研究结果为进一步开展VvUGTs的功能解剖和酿酒葡萄的遗传改良奠定了重要基础。

  糖基化是所有生物体内的重要修饰。糖基转移酶(GTs)可以将糖基从活化的供体分子转移到特定的受体分子。根据CAZy的最新更新，来自不同物种的GT可分为115个亚科，其中许多亚科已在不同物种中被鉴定出来。UGT通常在C端具有44个氨基酸的保守基序，称为植物次级产物糖基转移酶(PSPG)盒，其功能是结合糖基。从直径上看，N端序列变化很大，负责识别不同的底物。UGT在各种植物中得到了广泛的研究。UGT以多基因家族的形式存在，并在许多植物中扩展。在拟南芥中发现了100多个UGT基因。在其他植物物种中也发现了更多的UGT成员，如玉米(147)、小麦(179)、柑橘(145)、苹果(214)和桃子(168)。

  UGT在植物的各种生命活动中起着至关重要的作用。许多研究表明，UGT参与调节植物的次生代谢和激素稳态。例如，拟南芥、桃子、草莓和猕猴桃中的UGT79B1和UGT91A1被发现介导花青素修饰。据报道，在柑橘中，Cm1_2RhaT、CsUGT76F1和cs1,6rhat催化类黄酮糖基化。在拟南芥中，UGT74E2基因通过吲哚-3-丁酸(IBA)的糖基化参与植物形态发生和胁迫反应。在番茄中，抑制SlUGT75C1通过增加ABA水平和促进乙烯的早期释放显著加速果实成熟。UGT84B1和UGT74D1通过IAA和oxaa双糖基化调节植物发育过程中的IAA水平。植物UGT的功能也与胁迫反应有关。在拟南芥中，过表达UGT75B1基因提高了盐胁迫和渗透胁迫下的种子萌发率和幼苗绿苗率。在水稻中，OsUGT3被鉴定并发现通过调节ABA合成和清除ROS在干旱和盐胁迫中起关键作用。在没有病原体的情况下，UGT76B1作为sa依赖性植物防御的负调节因子，增强JA反应，延缓衰老的发生。

  葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上非常重要的水果作物，其果实含有特殊的风味和丰富的营养成分。它可以新鲜或干燥食用，也可以加工成各种产品，如果酱、果汁、葡萄酒、醋和葡萄籽油。在这项研究中，我们对葡萄UGT基因家族进行了富集分析并研究了VvUGT基因在不同发育阶段各组织和果实中的表达规律。此外，还研究了在干旱和盐处理下，VvUGT基因在刺激诱导下的表达模式。该研究将为进一步研究葡萄UGT基因的功能特性提供重要依据。

  1 材料与方法

  1.1 UGT基因启动子顺式作用元件分析及富集分析

  利用Tbtools软件从葡萄基因组中提取UGT基因启动子区（基因组编码区上游的2000 bp序列）。然后使用PlantCARE数据库预测VvUGT启动子区域的顺式调控元件。使用TBtools对VvUGT进行GO和KEGG富集分析。

  1.2 UGT家族基因成员表达特征分析

  VvUGT基因在不同组织和非生物胁迫(干旱和盐胁迫)下的表达数据来自NCBI (GSE36128和GSE31677)。另外利用白葡萄品种小白玫瑰(Muscat Blanc)和红葡萄品种小红玫瑰(Muscat Rouge)两个葡萄品种的转录组数据，研究了VvUGT基因在葡萄果实不同发育阶段的表达谱。每个葡萄品种有三个果实发育阶段:幼果期、转色期和成熟期。计算Fragments Per kb Per Million reads (FPKM)值来评估基因表达。将得到的VvUGT基因FPKM值进行log2变换，并使用TBtools软件将其可视化为热图。

  2 结果与分析

  2.1 葡萄UGT基因富集分析

  为了了解VvUGTs的生物学过程，我们使用TBtools进行了功能富集分析如图1;2所示 GO分析发现，VvUGT家族成员主要集中在转移酶活性上，如槲皮素3- o -葡萄糖基转移酶活性、槲皮素7- o -葡萄糖基转移酶活性、己糖基转移酶活性、类黄酮和类黄酮代谢过程等途径如图1所示。KEGG富集分析发现了VvUGT家族的一些相关代谢途径，包括硫代葡萄糖苷生物合成、tryptophan代谢、萜类和多酮类代谢;氨基酸代谢、花青素生物合成以及其他各种次生代谢物的生物合成如图2所示。根据KEGG和GO的结果，我们鉴定出14个VvUGT基因参与类黄酮合成途径。它们是VvUGT60、VvUGT61、VvUGT62、VvUGT63、VvUGT79、VvUGT80、VvUGT81、VvUGT124、VvUGT165、VvUGT166、VvUGT167、VvUGT168、VvUGT169、VvUGT170。这些与类黄酮生物合成相关的候选VvUGT基因将为进一步研究植物次生代谢产物调控机制提供依据。

  2.2 葡萄UGT基因表达特征分析

  （1）VvUGT基因在果实不同部位中的表达特征

  根据芯片数据分析了VvUGT基因在根、茎、叶、花和果实5个组织中的表达模式如图3所示，结果显示，在所有组织中共表达了60个VvUGT基因。VvUGT99在根中的表达量高于其他组织。8个VvUGTs (VvUGT87、VvUGT97、VvUGT116、VvUGT119、VvUGT120、VvUGT125、VvUGT129和VvUGT134)在葡萄各组织中均有高水平表达，表明它们在葡萄生长发育中起着重要作用。VvUGT124和VvUGT79分别在果实和花中高表达。

  （2）果实不同发育阶段VvUGT基因表达特征

  为了了解VvUGT基因在果实发育中的潜在功能，我们研究了两个葡萄品种，包括“小白玫瑰”和“小红玫瑰”，在三个发育阶段的转录组数据如图4所示。结果显示，32个VvUGTs在任何阶段都未被检测到，而149个VvUGTs在不同阶段都有表达。其中，13个VvUGT基因在果实发育各阶段均表现出高表达，可能在果实发育过程中起作用。在‘小白玫瑰’中，VvUGT10和VvUGT12在幼果期高表达，VvUGT134和VvUGT145在转色期高度表达。VvUGT10、VvUGT51、VvUGT134和VvUGT145在成熟期高度表达。在小红玫瑰成熟期也观察到类似的情况。在小红玫瑰中VvUGT10、VvUGT12和VvUGT13基因在幼果期的表达量低于小白玫瑰，而VvUGT22和VvUGT124基因在转色期和成熟期的表达量均高于小白玫瑰。

  （3）非生物胁迫下VvUGTs基因表达特征

  为了进一步分析VvUGT基因在非生物胁迫下的表达特征，本研究考察了VvUGT基因对盐胁迫和干旱胁迫的响应如图5所示。在盐胁迫和干旱胁迫下，有24个VvUGT基因表达。在盐胁迫下，8个基因(VvUGT12、VvUGT30、VvUGT36、VvUGT59、VvUGT104、VvUGT122、VvUGT124和VvUGT133)在盐胁迫处理16 d后表达量下降。7个基因(VvUGT25、VvUGT40、VvUGT69、VvUGT97、VvUGT107、VvUGT125、VvUGT179)在盐胁迫下呈增加趋势。干旱胁迫下，16 d后，VvUGT125表达显著上调，而VvUGT122表达显著降低。总体而言，盐胁迫和干旱胁迫下基因表达趋势相似。

  3 讨论与结论

  UGT参与植物次生代谢产物的糖基化和修饰，在植物生长发育和逆境响应中发挥重要作用。葡萄是世界上重要的水果作物之一，可用于鲜食还可以制作果汁和葡萄干，它也是葡萄酒行业的重要原料。同时UGT基因参与并影响葡萄单宁的合成与代谢，因此，为了研究VvUGT基因的功能，我们对影响葡萄单宁合成与代谢的UGT基因家族进行了富集和表达分析。KEGG和GO富集分析显示，VvUGT60、VvUGT61、VvUGT62、VvUGT63、VvUGT79、VvUGT80、VvUGT81、VvUGT124在类黄酮合成途径中富集。其中，我们发现VvUGT124只在红色品种‘Muscat Rouge’中表达，而在果实变异后的白色品种‘Muscat Blanc’中几乎不表达。其中，VvUGT124的表达量在转色期中显著上调，且表达量随着果实的成熟而增加。葡萄中的UFGT基因也有类似的表达模式。

  许多研究表明，UGT基因在植物生长发育中起作用。如图3所示，共鉴定出60个VvUGT基因在所有组织中表达。其中，VvUGT97和VvUGT119基因在叶和根中的表达水平高于其他组织。VvUGT99仅在根中高表达，说明VvUGT99可能在根发育中起特定作用。VvUGT124在果实中的表达量明显高于其他组织，这表明该基因可能与果实发育有关。非生物胁迫会严重影响植物生长和生产力，造成经济损失。另外，在葡萄的生长过程中，其单宁的含量会因田间措施的改变而改变，因此研究非生物胁迫对参与单宁合成过程的UGT基因家族的影响十分重要。本研究探讨了盐胁迫和干旱胁迫下VvUGT基因的表达模式。结果表明，干旱胁迫下，VvUGT25的表达量呈上升趋势，先下调后显著升高，并在盐胁迫16 d时达到最高表达量。这表明，VvUGT25在介导植物对干旱和盐胁迫的响应中发挥了重要作用。相比之下，VvUGT122和VvUGT124在干旱和盐胁迫下始终保持下降趋势，说明VvUGT122和VvUGT124的表达受到了非生物胁迫的抑制。在水稻中，有报道称UGT85E1基因通过增强脱落酸响应参与干旱胁迫耐受性。来自白颖苔草的CrUGT87A1可以通过在拟南芥中积累抗氧化类黄酮来提高盐耐受性。在水稻中，OsUGT90A1的表达最初是由低温诱导的，其过表达有助于在冷胁迫下维持膜的完整性。在山茶中，CsUGT78A14通过增加黄酮醇积累和清除ROS能力在冷胁迫中发挥关键作用。综上所述，VvUGT基因在植物生长发育和对非生物胁迫的响应中起着关键作用。这些结果表明，UGT家族可能在植物的非生物胁迫响应中发挥重要作用。

  次生代谢物与果实风味密切相关，有助于改善果实颜色，其含量对葡萄特性和葡萄酒品质有重要影响。近年来，已经鉴定出几个与类黄酮包括单宁生物合成相关的基因，包括UGT基因。在石榴中，PgUGT95B2对黄酮和黄酮醇表现出强烈的偏好，并能在多个位置糖基化底物分子。其同源基因VvUGT5在两个葡萄品种果实发育的三个阶段均表现出高表达水平。这一结果表明，VvUGT5可能参与了果实发育过程中单宁代谢的调节。据报道，PaUGT2在樱桃中对多种黄酮醇和花青素具有糖基化作用。在本研究中，与PaUGT2高度同源的VvUGT53在转色期中表现出更高的表达水平，表明VvUGT53可能在转色阶段起作用[180]。前期研究表明，VvUGT124的同源基因UGT78D2参与了拟南芥花粉中黄酮醇向黄酮醇3- o -糖苷转化的过程。这一结果显示，VvUGT124可能不仅参与了单宁的合成过程还参与了葡萄转色过程中次生代谢的调控，UGT家族在葡萄单宁合成过程中的作用机制尚需进一步的实验探索。