病毒病防控岗位

范旭东 董雅凤

  葡萄星状花叶相关病毒 (grapevine asteroid mosaic-associated virus，GAMaV)是Tymoviridae病毒科的Marafivirus属的一员，2003年由澳大利亚学者Ghanem-Sabanadzovic发现并报道。此后，在希腊、日本、加拿大、乌拉圭、法国、匈牙利、意大利、西班牙、瑞士和俄罗斯，以及北美一些自由生长的葡萄藤被发现，是发生范围较为广泛的一种葡萄病毒。前人的研究推测GAMaV可能与葡萄星状花叶病的发生有关。我国之前尚未报道葡萄星状花叶相关病毒的发生，因此，有必要鉴定和明确该病毒在我国葡萄上的发生、危害情况。本研究采用高通量测序技术从一株表现褪绿斑驳的赤霞珠葡萄植株中鉴定到了GAMaV，并采用RT-PCR的方法对429棵葡萄树进行GAMaV的检测，明确了GAMaV在我国的发生分布情况。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  用于高通量测序的样品为赤霞珠葡萄，种植在辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心毒源保存圃。用于GAMaV检测的样品从21个省市自治区的71个葡萄样品采集，保存在辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心毒源保存圃。

  1.2 高通量测序

  采集表现症状的葡萄叶片，液氮速冻后，通过干冰运输至北京百迈克生物科技有限公司，委托其利用Illumina HisSeqTM 2000高通量测序平台进行高通量测序，测序方式为去核糖体的LncRNA测序。

  1.3 数据分析

  LncRNA测序经过质控后移除低质量数据，然后与葡萄基因组进行比对过滤，未比对上的测序数据进一步采用spades软件进行组装和分析。其中，spades软件组装后的contigs与NCBI病毒数据库进行blast比对，明确样品的病毒种类。

  1.4 GAMaV contigs序列PCR验证

  根据获得来源GAMaV的conitgs序列，通过与NCBI已登录GAMaV分离物进行序列比对，确定获得的中国GAMaV分离物保守结构域Hel结构域和CP基因的部分序列。根据Met和CP基因序列设计了两对引物GAMaV-mel1a/1b (5′-CACCTCGCCCCCTACCTTGAC-3′/5′-AAGAGGACGCCTTTGCGGGAG-3′) and GAMaV-cp1a/1b (5′-CTAGCGACGACCGCACTGATC-3′/5′-GTCGGTGTACGAGATTTGGTC-3′)，对测序的赤霞珠样品进行PCR扩增，并对获得的PCR产物进行Sanger测序。

  1.5 田间样品的GAMaV检测

  提取429葡萄样品的总RNA，并进行反转录。采用上述引物对反转录的cDNA进行PCR检测，并对阳性样品的PCR产物进行回收、克隆及测序。

  2 结果与分析

  2.1 高通量测序结果及分析

  高通量测序产生了39,297,567 条序列。通过将测序数据与葡萄基因组（PN40024）比对，过滤到葡萄寄主来源的序列，产生了未必对上的序列共15,003,158条。通过SPAdes v3.15.3 软件进行拼接，结果获得70,152条conitgs片段。对conitgs序列进行blanstn和blastx比对，结果表明该样品中存在5种病毒和2种类病毒，分别为葡萄星状花叶病毒、灰比诺葡萄病毒、葡萄浆果内坏死病毒、沙地葡萄茎痘病毒、葡萄红地球病毒、葡萄黄斑类病毒和啤酒花矮化类病毒。图1表示拼接获得GAMaV的conitgs及在参考基因组的位置

  2.2 GAMaV contigs序列PCR验证

  对赤霞珠样品中的GAMaV的进行RT-PCR扩增（图2），扩增得到的和片段进行回收、克隆及测序，结果表明获得的329 bp和440 bp片段与GAMaV分离物GV30的同源性为91.2%和93.4%，均为GAMaV特异性序列，进一步证明了该样品存在GAMaV。序列已提交NCBI上，登录号为OQ676951和OQ676958。

  2.3 GAMaV病毒的检测

  为了明确GAMaV在葡萄样品中的发生情况，进一步对429个葡萄样品进行了病毒检测，结果，该病毒在这些样品中的检出率为1.4%（6/429）。对获得的阳性条带进行回收、克隆及测序，结果，获得Hel结构域序列（OQ676952~ OQ676957）与GV30分离物的同源性为84.5%~89.1%， 而CP基因序列同源性为93.6%~93.9%。