育种方法与技术岗位

  葡萄常规的遗传转化体系大多以无菌材料为侵染对象，需要大量的时间进行愈伤组织的诱导、分化和继代，周期较长，技术要求严。因此，本方法以葡萄种子苗为材料，利用发根农杆菌介导建立一种不依赖组培技术的高效诱导转化体系，为今后开展葡萄特定的基因功能研究和遗传改良奠定基础。为获得较好的效果，具体方法如下：

  （1）种子播种：将沙藏1个月以上的葡萄种子播种至土壤培养皿中，25℃组培室（16 h光照/8 h黑暗）培养40-50 D，待长出3~4片子叶时，准备侵染。

  （2）农杆菌活化及收集：将pnmg-gfp载体通过化学转化法至MSU440发根农杆菌菌株，并涂板于50mg·L-1 Kan, 50 mg L-1 Stre的LB固体培养基中。挑取单克隆用含有相同抗生素的LB液体培养基摇菌OD600至0.8，5000 rmp 10 min 收集菌液并使用MES缓冲液（10 mM MES，10 mM MgCl2，100 μM乙酰丁香酮）调整OD600至0.2。

  （3）注射侵染：定位植株靠近下胚轴区域0.5~1 cm茎区区段进行农杆菌注射，如图1a-b所示，将0.1 ml的农杆菌悬浮液注射至相对应区域。完成注射后，刮取培养板上的农杆菌涂抹至注射伤口位置处（图1c）。

  （4）植株培养：将完成注射植株放置于25℃组培室（16 h光照/8 h黑暗）培养，培养阶段注意植株保湿（盖培养盖）。如图1d-e所示，植株在7 d左右伤口膨大，14 d左右新生根显著增长。30~40天后植株处于快速发根期，可将原生根切断。

  （5）根部观察：使用488 nm光源观察植株根部GFP发光情况，如图1f-g所示，与野生型植株CK根部相比转基因植株根在488 nm波长光源下散发绿色荧光，表明发根农杆菌可介导葡萄下胚轴形成转基因毛状根。