酿酒葡萄栽培岗位惠竹梅
张柯楠
1 目的意义
云南香格里拉干旱河谷葡萄产区是世界上海拔最高的葡萄产区之一，葡萄在海拔1900~2600 m区域内均有种植。葡萄种植作为该地区的支柱产业，种植面积多达3万亩，种植品种包括赤霞珠、梅尔诺、雷司令等世界著名酿酒品种。对于酿酒葡萄品种，葡萄原料品质决定葡萄酒品质，近年来关于该产区葡萄品质研究较多。该产区气候光照充足，昼夜温差大，适合酿造高品质葡萄酒。海拔作为主要的地形因子，显著影响该产区葡萄与葡萄酒品质。但是目前关于海拔影响葡萄品质的内在机理研究较少，影响葡萄品质的主要气候因子不能明确。因此，深入了解海拔影响葡萄品质方式，有助于该产区葡萄品质调控和差异化葡萄酒产品开发。
目前关于海拔高度对葡萄酚类物质影响的研究较多，但不同海拔高度酿酒葡萄品质尤其是酚类物质差异的成因研究较少，还需进一步深入研究。本研究以酿酒葡萄梅尔诺（Merlot）为试材，分析不同海拔成熟期葡萄果皮总酚、总类黄酮、总单宁、总花色苷、非单体花色苷酚类物质含量差异；同时，在葡萄生长发育期监测不同海拔葡萄园的气候因子，从气候因子角度综合探究不同海拔高度葡萄果皮酚类物质含量积累差异的原因，为不同海拔葡萄优质生产提供理论依据。
2 材料与方法
2.1 试验地点
本试验于2020、2021和2022年在云南香格里拉产区德钦葡萄基地（28°10′ N，98°52′ E）进行，试验设置2个海拔高度，分别为2 181 m和2 300 m（图1）。供试材料为欧亚种酿酒葡萄‘梅尔诺’（Merlot），定植于2008年，南北行向，株行距1.0 m×1.5 m，树形为单干双臂，采用短梢修剪，新梢间距为10—15 cm，叶幕高度和宽度分别为140 cm和80 cm，灌溉方式为滴灌，采用常规葡萄园管理方式，施肥、灌溉、病虫害防治采用相同标准。
2.2 试验材料
在果实转色后，每隔3-5 d随机采集试验区果实样品测定可溶性物含量及含酸量，监测果实成熟曲线，当果实可溶性物含量趋于稳定不再上升（即27%左右），且种子变为棕褐色时采集葡萄样品。于每个海拔葡萄园随机选取10株生长势一致的葡萄植株，在每株葡萄树的阳面和阴面各采集一穗葡萄，共20穗，果粒剪下混匀后于-40 ℃下保存待测，重复3次。样品用于测定葡萄果皮的总酚、总花色苷、总类黄酮、总单宁及非花色苷单体酚类物质含量。
2.3 测定方法
2.3.1 气象指标监测方法
2021年的5~9月监测各海拔主要气候因子。采用温湿度记录仪（RC－4HC，中国江苏省精创电气公司）测定每个海拔高度葡萄园5~9月的空气温度和相对湿度，温湿度记录仪放置在葡萄果穗附近，距离地面1.5 m，每隔30 min记录一次。在每月选择晴天于上午11:30~12:30采用数字照度计（Z-10，中国深圳格信达科技有限公司）、紫外辐射照度计（UV340B，中国西安欣宝科仪电子科技有限公司）和光纤光谱仪（FX2000，中国上海复享光学股份有限公司）分别测定2个海拔葡萄园5~9月的光照强度、紫外线强度和不同光质（300~1000 nm）光照相对强度。
2.3.2 果实指标测定方法
2.3.2.1果实酚类物质含量的测定
参考Tian等方法，随机选取葡萄50粒在－80 ℃下冷冻，立即剥取葡萄皮，将葡萄皮液氮冷冻并粉碎成粉末后装于培养皿中，在冻干机中冻干24 h，取出装于自封袋中，存放于－80℃冰箱中。提取时，称取1 g干粉于50 mL离心管中（离心管要用黑胶带或锡箔纸包裹），加入20 mL盐酸甲醇溶液（体积分数60%甲醇，质量分数0.1%盐酸）使料液比为1∶20，超声提取器中于水温30 ℃，40 W功率下提取30 min，接着于4 ℃下10000 r/min离心10 min，收集上清液于丝口瓶中。然后在沉淀物中加入20 mL盐酸甲醇，重复以上提取步骤2次，合并3次所有上清液摇匀并于－80℃冰箱中储存。以上操作均要避光操作。
总花色苷的测定采用pH示差法；以甲基纤维素沉淀法测定总单宁含量，结果以儿茶素表示；采用福林-肖卡法测定总酚含量，结果以没食子酸表示；采用P-DMACA-盐酸法测定总黄烷醇含量，结果以儿茶素表示；总黄酮含量的测定采用Peinado等[28]的方法，结果以芦丁含量(mg·g-1) 表示。
2.3.2.2非单体花色苷含量的测定
葡萄果皮非花色苷单体酚类物质的提取：每个样品设置3个生物学重复，每个生物学重复随机取葡萄100粒，于-80 ℃预冷并去皮，在液氮中磨成粉末后在真空冷冻干燥器（Goldsim Cellular Science LLC，USA）中冻干24 h。取葡萄果皮干粉2 g 溶于45 mL乙酸乙酯，加入5 mL蒸馏水，在25 ℃条件下摇床振荡30 min（避光，130 r/min），12 000 r/min、4 ℃离心20 min，将上清液转移至100 mL丝口瓶中，重复上述步骤3次。合并4次上清液并转移至圆底烧瓶，在33 ℃条件下旋转蒸发至干，用色谱级甲醇重溶定容至5 mL，-20 ℃避光存放待测。
非花色苷单体酚类物质含量的测定：提取液0.22 μm有机滤头过滤，采用LC-2030CD高效液相色谱仪（岛津，日本）和二极管阵列检测器（岛津，日本）进行测定。色谱条件：色谱柱为ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent，USA）。梯度洗脱：流动相A：水﹕乙酸（1﹕99，V/V），流动相B：乙腈。洗脱程序：0—3min，3%—6% B；3—7 min，6%—15% B；7—11 min，15%—30% B；11—13 min，30% B；13—15 min，30%—3% B。流速0.20 mL·min-1，柱温30 ℃，二极管阵列检测器检测波长280 nm，进样量10 μL，所有样品重复测定2次。以儿茶素、表儿茶素、槲皮素、山奈酚、绿原酸、咖啡酸、反式阿魏酸、对香豆酸、没食子酸、原儿茶酸、香草酸和丁香酸为标准品（索莱宝科技有限公司，中国），标准品纯度均为98%，分别准确称取标准品0.0100 g并以色谱甲醇定容得到10 mL单标溶液，分别对12种单标溶液梯度稀释5个不同浓度（重复3次），在上述色谱条件下分析各标准品并绘制标准曲线，标准曲线的相关系数在0.999以上。结合各标准品的保留时间对样品进行定性。结合标准曲线采用外标法对样品进行定量分析。果皮中非花色苷单体酚类物质含量用“mg·g-1 DW”表示
2.4 数据分析
采用Microsoft Excel 2016进行数据统计，使用IBM SPSS Statistcs 25.0进行单因素方差分析和相关分析，采用Turkey极差法（P＜0.05）进行差异显著检验，使用SMICA14.1（Umetrics，SE）进行正交偏最小二乘分析。
3.初步结果
3.1 不同海拔葡萄生长发育期气候因子参数
由图1-A可以看出，2021年两个海拔葡萄园生长季（5—9月）及各月份最高、平均和最低空气温度在两个海拔之间无显著差异；在2022年，海拔2 181 m葡萄园6月、生长季（5—9月）最高及平均空气温度显著高于海拔2 300 m，但两个海拔最低空气温度无显著差异；海拔2 300 m连续两年生长季（5—9月）昼夜温差显著高于2 181 m，两个海拔昼夜温差在不同月份差异不同，两个海拔7、8月昼夜温差无显著差异，而在2022年6月和9月出现显著差异。
由图1-B可以看出，在2021年两个海拔生长季（5-9月）及各月份相对湿度无显著差异；在2022年，海拔2 300 m生长季（5-9月）及各月份最高相对湿度均显著高于2 181 m，海拔2 300 m平均相对湿度除6月显著高于2 181 m外，其余月份两个海拔葡萄园平均相对湿度无显著差异，而在5月和6月，海拔2 300 m最低相对湿度显著低于2 181 m，其余月份两个海拔最低空气相对湿度无显著差异。
3.2 不同海拔葡萄果皮酚类物质含量
2020-2022年，海拔2 300 m处葡萄果皮的总酚（TPC）、总花色苷（TAC）和总单宁含量（TTC）均显著高于海拔2 181 m；相比于2020和2022年，2021年海拔2 300 m处葡萄总花色苷（TAC）和总单宁（TTC）较海拔2 181 m增加幅度大，分别增加了44.34%和174.49%。2020—2022年，海拔2 181 m处葡萄果皮的总类黄酮含量（TFo）连续3年显著高于2 300 m，提高幅度分别为32.24%、57.64%和79.48%（图3）。
表1可以看出，不同海拔葡萄果皮共检测出12种非花色苷单体酚类物质，包括2种黄烷醇类，2种黄酮醇类、4种羟基肉桂酸类和4种羟基苯甲酸类，其中槲皮素的含量较高，其次是山奈酚。在2021和2022年，海拔2 300 m葡萄果皮槲皮素含量显著高于2 181 m。在黄烷醇类物质中，较高海拔葡萄果皮表儿茶素含量高于海拔2 181 m，其余2022年两个海拔之间差异显著；非类黄酮物质包括羟基肉桂酸类和羟基苯甲酸类，在2021年两个海拔葡萄果皮中羟基肉桂酸类和羟基苯甲酸类物质含量无显著差异，而在2022年海拔2 300 m葡萄果皮的绿原酸、反式阿魏酸、对香豆酸、没食子酸和香草酸含量显著高于海拔2 181 m。
3.3 不同海拔葡萄果皮酚类物质的OPLS-DA分析
为进一步探究海拔对葡萄果皮酚类物质含量的影响，建立OPLS-DA模型进行正交偏最小二乘回归分析。如图3所示，采用2020、2021和2022年葡萄果皮的总酚、总类黄酮、总单宁、总花色苷及单体花色苷数据构建模型，同时对模型进行200次置换检验。一般而言，置换检验后intercept Q2＜0说明模型无过度拟合现象，R2值＞0.7说明模型有较好的解释能力，Q2值＞0.5说明模型有较好的预测能力。本试验构建的模型intercept Q2值为-0.98，R2值为0.74，Q2值为0.53，说明模型有效且筛选差异化合物能力较好。通过模型筛选VIP值＞1的酚类化合物发现，海拔2 181 m和海拔2 300 m葡萄果皮的主要差异化合物是总类黄酮（TFo）、总单宁（TTC）、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（Mv）及其乙酰化（Mv-Ace）、花青素-3-O-葡萄糖苷（Cy）及其甲基化（Pn）。
3.4 气候因子与赤霞珠葡萄品质的关联分析
从潜变量来看，温度对葡萄品质的直接影响最大，其次是极端空气温度，光照的直接影响较小。此外，极端空气温度对葡萄品质的影响是负面的。总影响包括直接影响和间接影响，光对葡萄品质的总影响最大，其次是温度和极端温度。光对葡萄品质的总效应最大(0.463)，直接效应最小(0.109)，说明光对葡萄品质的间接效应显著。光与温度之间的显著通径系数(0.767**)表明光对葡萄品质的调控主要是通过影响温度来实现的。同时，SEM分析表明，AT30°C(通径系数=-0.235**)和NightAT(通径系数=-0.294**)不利于葡萄果皮花色苷的积累。
4 总结
不同海拔气候条件显著影响葡萄品质，光照强度、空气温度和土壤温度是引起葡萄品质差异的主要气候因子。对于赤霞珠葡萄，较高海拔2430 m和2540 m较强得光照有利于葡萄果皮总单宁的积累，较低的土壤温度和白天空气温度有利于花色苷的积累；低海拔1987 m充足的热量促进葡萄生长及反式阿魏酸等酚类物质的积累；海拔2300 m光温条件较好，不仅为葡萄生长和果皮总酚、黄烷醇等酚类物质的积累提供了足够的热量和光照，同时该海拔合适的土壤和白天空气温度有利于花色苷物质的积累。对于梅尔诺葡萄，较高海拔（2300 m）较大的昼夜温差、较强的光照和紫外线促进了葡萄果皮总酚、槲皮素类黄酮醇和总花色苷及其单体物质含量的积累。综上，海拔2300 m气候条件有利于种植高品质的梅尔诺葡萄。