酿酒微生物岗

刘延琳

  1. 氨基甲酸乙酯的危害

  氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）又称尿烷、乌来糖、乌来坦、乌拉坦，分子式为C3H7NO2，是烟草叶及香烟的天然成分，也是发酵食品（如面包、乳酪、酸奶等）和酒精饮料（如葡萄酒、日本清酒和中国黄酒等）在发酵或贮存过程中天然的伴随产物。

  EC具有口服毒性，同时具有多位点致癌性，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病。人体摄入EC绝大部分是通过饮用酒精饮料，其中，葡萄酒是重要来源之一。2002年联合国粮食及农业组织确定EC为重点监控物质，并制定了国际标准，规定葡萄酒中其质量浓度不得超过20 μg/L，加拿大和美国佐餐葡萄酒中EC 的限量不得超过 30 μg/L 和 15 μg/L。中国目前尚未制订EC限量标准2007年，世界卫生组织国际癌症机构将EC由2B类致癌物（或可能令人患癌的物质）正式归为2A类致癌物（可能令人患癌的物质），并限制了其使用范围。

  2.氨基甲酸乙酯的产生机制和分子标志物

  葡萄酒酿造过程中，EC的形成有5 条途径，即尿素、瓜氨酸、氨基甲酰磷酸、氰化物、3a,6a-二甲基甘脲（3a,6a-dimethylglycoluril，DMGU）与乙醇反应形成EC（Zimmerli等，1991；Wang等，2014）。尿素和瓜氨酸（主要来自于精氨酸的酵母和乳酸菌的新陈代谢）与乙醇的反应是EC的主要形成途径（Arena等，1999；Cerreti等，2016）。在这两条主要的形成途径中，因为尿素浓度常高于瓜氨酸浓度，且瓜氨酸的醇解反应速率较低，所以EC主要来源于尿素形成途径（Moreno-Arribas等，2016）。

  在葡萄酒中，EC前体物质的来源有多种途径。葡萄生长过程中，施用氮肥使果实中尿素含量增加；发酵过程中，酵母菌通过尿素循环途径，代谢底物中过量的精氨酸产生尿素（Bells等，2005），并释放到发酵液中，使酒中尿素含量升高（Mira等，2000）。瓜氨酸主要来自酿酒酵母细胞内的尿素循环途径和乳酸菌中的精氨酸脱亚氨基酶代谢途径（Vrancken等，2009；Azevedo等，2002）。酿造过程中，酵母降解精氨酸生成尿素和鸟氨酸，鸟氨酸在鸟氨酸氨甲酰转移酶的作用下，生成瓜氨酸  ；苹果酸乳酸发酵过程中，乳酸菌代谢精氨酸也会分泌瓜氨酸（Mira等，2000）。酵母和乳酸菌代谢精氨酸代谢产生的瓜氨酸部分与乙醇直接反应生成EC，部分在鸟氨酸氨基甲酰转移酶的作用下生成氨甲酰磷酸和鸟氨酸，氨甲酰磷酸与乙醇进一步生成EC。葡萄酒中EC前体物质氰化物有两种来源，一是葡萄籽中的氰苷水解形成氰化物，由铜离子催化，氧化形成氰酸盐，氰酸盐与乙醇反应生成EC（Zimmerli等，1991；Zhao等，2013） ；二是在白兰地的蒸馏过程中，高温使部分尿素分解成氰酸，氰酸与乙醇反应生成EC。双乙酰和尿素反应生成DMGU，DMGU与乙醇反应生成EC。

  3.影响氨基甲酸乙酯含量的因素

  影响葡萄酒中EC含量的因素是原料状况和工艺，原料状况的影响包括：生态条件（温度、降水、极端气候）（Moreno-Arribas等，2016）、葡萄品种（Arena等，2013）、葡萄成熟度（Lago等，2017）及产区（Moreno-Arribas等，2016）；工艺的影响包括发酵条件和陈酿条件，其中发酵条件包括：酒种（Fu等，2016；Canas等，2008）、pH值（Jiao等，2014；Araque等，2013）、EC前体物质浓度（Bell等，2005；Zhao等，2013）和乙醇体积分数（Araque等，2013）等。

  3.1.原料成熟度

  研究表明，采用技术成熟前（19 °Brix）、理想成熟度（21 °Brix）及过熟（23 °Brix）的葡萄分别浸渍10 d，葡萄酒中EC质量浓度分别为23.6、66、96 μg/L（Lago等，2017），由此可见，葡萄成熟度与葡萄酒中EC质量浓度呈正相关。

  3.2.发酵条件

  发酵过程中，发酵温度、浸渍时间、葡萄汁营养剂添加、酵母种类、乳酸菌种类及EC前体物质浓度是影响葡萄酒中EC含量的重要因素。发酵温度可以影响EC的形成速度，发酵后期升温会加快EC的形成（Wang等，2014）。实验表明，浸渍时间通过影响EC前体物质的浓度影响EC含量，使用理想成熟度（21 °Brix）的葡萄浸渍10 d EC质量浓度为66 μg/L，继续浸渍至20 d以上时EC质量浓度为76.3 μg/L，浸渍30 d EC质量浓度可达89 μg/L（Lago等，2017）。尿素、瓜氨酸、精氨酸作为EC重要的前体物质，在葡萄汁中的含量影响着发酵结束后葡萄酒中EC的含量（Stevens等，1993）。研究表明，葡萄汁中尿素、瓜氨酸、精氨酸含量与EC生成量均呈线性关系（Hasnip等，2004）。在葡萄汁发酵前分别添加尿素、瓜氨酸，二者含量在发酵过程中均呈下降趋势，但EC含量不断增加，尿素的减少主要发生在酒精发酵过程中，且尿素代谢调控方式与参与的调节剂有关（Zhao等，2013），而瓜氨酸的减少主要发生在苹果酸-乳酸发酵过程中。葡萄酒生产过程中，精氨酸含量先上升后下降，EC含量呈明显上升趋势。精氨酸含量上升可能是由于酵母自溶，含量下降可能是由于乳酸菌代谢精氨酸产生瓜氨酸，使EC含量上升。因酵母生长繁殖的需要，发酵时加入氮源（如磷酸氢二铵）能明显加快发酵速率，防止发酵“阻滞”（Hasnip等，2004；Marks等，2003）。但添加过量的磷酸氢二铵会导致尿素的形成，尿素是EC重要的前体物质，并且部分酵母菌株对磷酸氢二铵的加入时间敏感，这也会影响EC的生成量（Lago等，2017）。酿酒酵母代谢精氨酸以及分泌尿素具有菌株特异性，car1基因通过编码精氨酸酶影响发酵液中精氨酸的含量（Moreno-Arribas等，2016；Guo等，2016），调控精氨酸脱亚胺途径arc基因的表达量也可以影响精氨酸的代谢率（Araque等，2009；Araque等，2012）。葡萄汁中的精氨酸可在酵母菌内代谢产生过量的尿素，从而导致葡萄酒中尿素含量升高（Mira等，2000）。苹果酸-乳酸发酵阶段，乳酸菌通过精氨酸脱亚氨途径代谢产生瓜氨酸，瓜氨酸是EC另一重要前体物质，不同种类的乳酸菌代谢精氨酸能力不同，生成EC前体物质的浓度不同，导致EC的产量有较明显差异，实验表明短乳杆菌较戊糖片球菌能够积累更多氨基酸，产生更多EC（Araque等，2013；Lasik等，2013）。

  3.3.陈酿条件

  研究发现，刚酿造的新酒中，仅仅满足高尿素含量时，EC并不能大量产生。贮存条件会影响葡萄酒中EC的最终浓度，如贮藏温度、通氧量及是否带酒脚陈酿（Larcher等，2013）。贮存期间，葡萄酒中EC含量随着储存温度和时间的增加而增加（Weber等，2009），贮存30 d后，30 ℃下的葡萄酒样品中EC含量约为15 ℃时的1.5～2.0倍（Xue等，2015）。如果葡萄酒在陈酿期间处于通风状态，尿素则大部分被降解，积累减少，导致EC含量较少。带酒脚陈酿过程中，由于酵母自溶，EC的前体物质含氮化合物、氨基酸会逐渐释放到酒中，EC含量也因此有所增加（Moreno-Arribas等，2016；Terrade等，2006；Uthurry等，2006）。但有报道称，氨基酸含量低的葡萄所酿造葡萄酒即使延长与酒脚接触时间，也没有其他EC前体物释放（Hasnip等，2004）。

  4.产生氨基甲酸乙酯的微生物溯源

  4.1.酵母菌

  在丹魄和赤霞珠葡萄汁与所用酵母菌发酵过程中，在确定的温度和pH条件下，不会产生EC或仅产生离散水平的该化合物。这些发现与发酵过程中尿素，铵和精氨酸的变化是一致的。相反，当发酵混合物中某些细菌诱导苹果乳酸发酵时，酒类酒球菌的EC积累明显更高。这些细菌可以通过ADI途径代谢精氨酸，从而将潜在的EC前体释放到介质中，例如瓜氨酸，以及程度较小的氨基甲酰磷酸，后者具有很高的反应性，易被乙醇分解。苹果酸乳酸发酵后观察到的铵含量提示了这种机理。葡萄酒精氨酸水平高是酵母自溶的结果，可通过参与细菌使其降解。这连同尿素与存在的醇的缓慢反应一起产生大量的EC，尤其是当发酵是由酒类酒球菌而不是希氏乳杆菌诱导时（Uthurry等，2006）。

  EC是在葡萄酒发酵和储存期间通过乙醇与氨基甲酸酯化合物的自发化学反应形成的，其中氨基甲酸酯化合物包括酵母细胞释放的尿素，乳酸菌释放的瓜氨酸和氨基甲酰磷酸（Monteiro等，1989；Ough等，1998）。其中，酒精发酵过程中酵母细胞释放的尿素是葡萄酒中EC的主要前体（Monteiro等，1989）。在葡萄酒发酵过程中，尿素一方面来自于发酵原料，另一方面来源于精氨酸酶催化作用下的精氨酸降解（Wu等，2014）。精氨酸是葡萄酒中尿素最重要的来源，被精氨酸酶（由CAR1基因编码）切割为鸟氨酸和尿素（Monteiro等，1991）。尿素在细胞内的代谢主要是通过尿素羧化酶和脲基甲酸盐水解酶来完成，尿素首先在尿素羧化酶的作用下降解为脲基甲酸盐，进而在脲基甲酸盐水解酶的作用下，降解为铵盐和二氧化碳（Whitney等，1972）。其中尿素羧化酶和脲基甲酸盐水解酶是由多功能基因DUR1/2编码，且DUR1/2基因的转录受NCR的调控，即较好氮源存在时，DUR1/2基因的转录被抑制（Zhao和Zou等，2013）。酿酒酵母能够通过有DUR1,2基因编码的尿素酰胺酶的作用代谢尿素（Genbauffe等，1991；Whitney等，1973）。然而，尿素的降解并不总是立即跟随着精氨酸的代谢（Genbauffe等，1986）。因此，尿素通过由DUR4编码的尿素转运蛋白Dur4p被酵母细胞逐渐排出，并且可以稍后通过由DUR3编码的尿素转运蛋白Dur3p被重新吸收以用作氮源。发酵结束时，尿素的排泄和再吸收都会影响葡萄酒中尿素的含量（Ough等，1991）。

  4.2.乳酸菌

  目前，市面上绝大多数用于诱导苹果酸乳酸发酵的商业乳酸菌都是异源发酵的，属于乳杆菌属和球菌属。目前已有多种细菌被发现通过ADI途径降解精氨酸，如酒明串珠菌、希氏乳杆菌（Arena等，1999）和布氏乳杆菌（Liu等，1994） 等。通常乳酸菌和酒球菌被认为是参与乳酸发酵的最主要菌株（Granchi等，1998）。由于精氨酸在葡萄汁和葡萄酒中是最重要的氨基酸之一（Henschke等，1992），而高EC浓度的葡萄酒可能会超出法律限制，因此对乳酸菌从精氨酸降解中分泌瓜氨酸的能力评估显得显得十分重要，同样，瓜氨酸本身的去甲化也很重要。排泄的瓜氨酸可在精氨酸耗尽后被同一菌株重新利用（Liu等，1994），或被其他乳酸菌利用，因此无法用于形成EC。同样，排出的瓜氨酸可能被乳酸菌认为是腐败生物的底物。Granchi研究表明，从意大利葡萄酒中分离的大多数酒类酒球菌菌株在pH为5的合成培养基中降解了精氨酸并排泄了瓜氨酸（Granchi等，1998）。但是，中等pH值不能代表葡萄酒环境，葡萄酒的pH大约是在3~4之间。此外，Liu等人的研究发现了两个被测试的酒类酒球菌能够在pH 4时降解精氨酸，但在pH 3.2时不能降解（Liu等，1995）。Romero等人的研究表明，两种酒类酒球菌能够降解精氨酸并并排泄模拟酒中的瓜氨酸，在较高的pH（约为4）的测定中更为有利，而在较低温度下（22℃）发现精氨酸与瓜氨酸的转化率较低。在不同的研究条件下，所研究的植物乳杆菌不能降解精氨酸，也不会分泌瓜氨酸。在研究的酒类酒球菌中，EC的潜在形成与瓜氨酸的产生密切相关，在观察到更快的生长和代谢条件下，EC的潜在形成更高，因此，瓜氨酸是长时间储存后葡萄酒中EC含量的良好指示（Romero等，2009）。有研究证明，这些乳酸菌的精氨酸分解代谢涉及精氨酸脱氨基酶（ADI）途径（Liu等，1995），该途径是精氨酸降解最广泛的厌氧途径（Cunin等，1986），该途径包括三种酶，精氨酸脱氨基酶ADI、鸟氨酸转氨酶OTC和氨基甲酸激酶CK，催化下列反应：

  5.如何抑制氨基甲酸乙酯的产生

  目前，EC的抑制途径大致分为4 类：选用代谢工程技术选育优良菌株、改良发酵原料、优化发酵和陈酿条件以及外源添加酸性脲酶。酸性脲酶可以催化尿素分解形成氨和二氧化碳，尿素是EC重要的前体物质，因此一定条件下，向发酵完全的酒中添加酸性脲酶，尿素的分解能降低葡萄酒中的总酚和EC其他前体物质的浓度，从而达到控制EC含量的目的（Cerreti等，2016）。该方法不改变酿酒的酵母菌株及工艺条件，能够在保证原酒风味特征的前提下，有效降低葡萄酒中的EC含量，同时操作简便有效，具有良好的应用前景。自1999年起，欧洲已获准从发酵乳酸菌中提取的酸性脲酶在葡萄酒中应用（Cerreti等，2016）。但目前，我国的脲酶生产尚未产业化，主要依靠进口，这增加了生产成本及工艺复杂性（Fidaleo等，2006）。而且由于脲酶是一类以镍作为辅基的金属酶，镍残留会严重影响葡萄酒安全性（Dixon等，1975）。除此之外，通过添加尿素吸附材料、EC降解酶、EC吸附剂等途径去除酒中EC的研究越来越多，但目前此类研究都集中在黄酒（Zhou等，2017；Fang等，2015）。

  5.1.代谢工程技术选育优良菌株

  代谢工程技术为抑制尿素的产生或提高尿素在酵母中的代谢能力提供了新的途径。选育产尿素能力及精氨酸酶活力低的酵母菌株进行发酵，可以有效降低葡萄酒中的EC含量。此方法主要通过两条途径实现：一是增强参与尿素降解及转运相关酶的编码基因；二是沉默或敲除精氨酸酶编码基因（Araque等，2013；Gou等，2016；Araque等，2009）。近几十年来，人们对酒精饮料中EC的形成机理和预防EC积累的策略进行了大量的研究。Coulon等人（2006）通过过度表达DUR1,2基因开发了一种尿素降解工业葡萄酒酵母522DUR1,2，功能增强菌株522DUR1,2生产的霞多丽葡萄酒的EC含量减少了89%。随后，Dahabieh等人（2009）通过过度表达DUR3基因，创建了尿素降解工业葡萄酒酵母522DUR3，功能增强菌株522DUR3将霞多丽葡萄酒中的EC降低了81%。为了降低清酒、樱桃酒和黄酒三种酒精饮料中的EC浓度，构建了CAR1突变酵母。所有这些CAR1缺失突变酵母均能显著降低相应发酵酒精饮料中的EC，且与相应亲本菌株的发酵行为无显著差异（Schehl等，2007；Wu等，2014）。有研究证明，从商业酿酒酵母WY1中对一株具有两个CAR1等位基因缺失的重组菌株YZ22进行基因工程改造，以降低EC的产生。用YZ22发酵的葡萄酒样品中尿素和EC的产量分别降低了77.89%和73.78%。同时，在贮藏过程中，随着尿素浓度的降低，EC的形成速度明显减慢。用Cre/loxP系统去除KanMX标记基因，菌株YZ22在生长和发酵特性方面与亲本菌株基本相当（Gou等，2016）。

  5.2.改良发酵原料

  对发酵原料的优化主要体现在调整葡萄园管理措施上。葡萄的施肥、修剪、灌溉及地面覆盖等对葡萄汁中精氨酸浓度有很大影响（Soufleros等，2003）。因此，合理调整葡萄园管理措施，对葡萄原料进行优化，能够在一定程度上控制葡萄酒中EC的含量（Bell等，2005），目前鲜见具体改良方法的研究。

  5.3.优化发酵和陈酿条件

  葡萄酒的发酵和陈酿条件在一定程度上影响了EC的形成。发酵及贮存的温度越高，EC的生成量就越多（Hasnip等，2004），当EC质量浓度不超过15 μg/L时，低温贮藏可限制EC质量浓度的增加。研究表明，当温度升高10℃时，尿素和瓜氨酸形成的EC分别增加了1.5~2倍和1.5~2.5倍（Xue等，2015）。

  6.未来前景

  消费者对于食品安全及健康越来越关注，EC作为一种在葡萄酒中广泛存在的有害物质，在我国目前还没有相关限量标准。在我国市场上仍有部分产品的EC含量超出联合国粮食及农业组织标准，这对消费者的健康造成了潜在威胁。葡萄酒中EC的主要形成途径是尿素及瓜氨酸与乙醇的反应；影响EC含量的因素有原料状况和工艺；控制消除手段主要包括选用优良菌株、改良发酵原料、优化发酵和陈酿条件，以及外源添加酸性脲酶，具体优化条件仍需要进一步研究。加强对葡萄酒中EC的研究，制定我国葡萄酒中EC的限量标准，通过技术手段控制EC含量，为消费者提供安全健康的葡萄酒产品，对规范葡萄酒行业生产秩序、保护我国葡萄酒消费者的健康及促进葡萄酒行业的持续发展意义重大。