病毒病防控岗位

范旭东 董雅凤

  葡萄在无性繁殖和生长过程中极易感染病毒，感病植株受病毒长期持续危害，无法通过药剂治疗，严重影响葡萄产量和品质。葡萄是感染病毒种类最多的果树，目前已报道的病毒多达95种，其中约1/3的病毒可引起明显的症状和危害，导致树体长势减弱、叶片和枝条畸形、叶片变色（变红、变黄、褪绿、花叶、环斑）、木质部凹陷等。葡萄扇叶衰退病（Grapevine fanleaf degeneration disease，GFDD）是一类重要的葡萄病毒病，早期研究认为其病原为葡萄扇叶病毒（grapevine fanleaf virus, GFLV）和10余种其他线虫传多面体病毒属（Nepovirus）病毒。郭德银等（1991）最早采用间接ELISA方法从我国葡萄样品中检测到GFLV，但国内尚无其他线虫传多面体病毒侵染葡萄的报道。

  近年来，我国栽植的‘阳光玫瑰’葡萄病毒病发生普遍，多表现为植株长势减弱、叶片皱缩、褪绿、畸形等葡萄扇叶衰退病症状，为明确其病原，本团队采用高通量测序技术，从病株中鉴定到葡萄浆果内坏死病毒（grapevine berry inner necrosis virus，GINV），灰比诺葡萄病毒（grapevine Pinot gris virus，GPGV）和葡萄蚕豆萎蔫病毒（grapevine fabavirus，GFabV），未检测到GFLV和其他线虫传多面体病毒属病毒，明确了我国葡萄扇叶衰退病相关病毒种类。本文通过对上述病毒研究进展情况进行梳理和总结，可为有针对性地开展病毒检测和脱除，进而为有效防控葡萄扇叶衰退病提供参考。

  1 我国葡萄扇叶衰退病相关病毒分析

  葡萄扇叶衰退病（俗称扇叶病）在我国各主要葡萄产区均有发生，但一直对其病原缺乏深入系统研究。早期仅通过症状观察判断为扇叶病，后采用酶联免疫吸附法（ELISA）和PCR方法对GFLV进行检测，因仅针对目的病毒，因此不能检测到样品中的其它病毒。随着高通量测序技术的发展与应用，使全面检测样品中的所有病毒种类成为可能，对揭示引起葡萄病毒病害的病原具有重要意义。近年来，本团队采用高通量测序技术对部分表现扇叶衰退病的葡萄样品进行病毒鉴定，均未检测到GFLV，而是检测到GINV，GPGV和GFabV等新病毒[10]，进而明确了我国葡萄扇叶衰退病的主要病原。

  2. 我国葡萄扇叶衰退病相关病毒研究进展

  2.1 葡萄扇叶病毒

  上世纪60年代初首次报道GFLV可通过线虫传播，并将其汁液摩擦接种至昆诺藜、千日红、烟草等草本寄主。Hewitt等先通过剑线虫将GFLV传播至苋色蔾，再从感染的苋色蔾回接到葡萄植株，引起葡萄产生典型的葡萄扇叶病症状，从而完成了GFLV的柯赫氏法则验证，证明了GFLV是葡萄扇叶病的病原。葡萄扇叶病毒（grapevine fan leaf virus，GFLV）属豇豆花叶病毒科（Comoviridae）、线虫传多面体病毒属（Nepovirus）。病毒粒子球型，直径30 nm，基因组包括RNA1和RNA2两条链，不同分离株间无血清学差异，但存在症状差异，自然界中未发现葡萄以外的其他寄主。

  我国早期主要通过田间症状观察来确定GFLV侵染，具有一定的主观性。郭德银等（1991）采用间接ELISA方法对葡萄样品进行了GFLV鉴定，田间品种阳性率为74.3%，热处理试管苗阳性率为5.6%，国外引进的脱毒品种阳性率为17.7%。晁无疾等（1997）采用ELISA方法对北京地区葡萄样品进行检测，结果显示GFLV在北京地区发生普遍。谭雪莲等人（2005）对甘肃地区葡萄样品进行ELISA检测，GFLV检出率为13.3%。2000年以来，许多学者开始采用RT-PCR方法进行检测。张向昆（2019）对秦皇岛8个葡萄园5个酿酒品种435份葡萄样品进行调查，发现葡萄扇叶病普遍发生，但未检出GFLV。陈婕等（2019）对嘉兴地区6个县区的6个主栽品种162份样品进行检测，未检出GFLV。周敏（2014）从湖南主产区采集的54个表现症状的葡萄样品，29个样品检测到GFLV。周俊等（2015）研发了巢式PCR方法，大幅度提高了GFLV的检测灵敏度。2017年首次报道了GFLV中国分离物的基因组全长序列，其与国外分离物处于不同的进化分支。

  由于侵染葡萄的病毒种类繁多，症状复杂多变，很难将某种病毒与症状相对应，研究结果也显示，部分带病植株检测不到GFLV，故推测存在其它病毒引起类似症状。近几年，高通量测序技术发展迅速，可同时检测发病植株中的所有已知和未知病毒，对于病原鉴定具有革命性的意义。笔者对表现叶片褪绿斑驳、环斑、畸形等症状的葡萄样品进行高通量测序，均未检测到GFLV，而是多次检出GPGV、GINV和GFabV，表明引起我国葡萄扇叶衰退病的病原不仅仅是GFLV。

  2.2 灰比诺葡萄病毒   

  2012年，意大利研究人员首次发现灰比诺葡萄病毒（grapevine Pinot gris virus, GPGV），引起灰比诺、塔明娜、黑比诺等葡萄品种叶片褪绿斑驳、皱缩、变形等症状，与葡萄扇叶病极为相似。GPGV是葡萄上发生最普遍、危害最严重的病毒之一，目前已有20多个国家相继报道。研究表明GPGV可通过葡萄瘿螨进行传播，并且该病毒在田间存在草本寄主。GPGV为正义单链RNA病毒，是发状葡萄病毒属（Trichovirus）成员，其基因组由3个开放阅读框组成，分别编码复制酶（RP）、移动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP）。GenBank数据库登录的GPGV基因组全长序列已达200多条。

  感染GPGV的葡萄植株并非都表现明显症状，可能与葡萄品种对病毒的敏感性有关。一些敏感的品种并非一直表现明显症状，Bianci等（2015）发现，有症状植株的GPGV平均浓度显著高于无症状植株。Bertazzon等（2017）进一步证实了这一现象，指出严重症状的发生与较高的病毒浓度有关。Saldarelli等（2015）对92个GPGV分离物基因组序列进行比较分析，发现MP基因3’端和CP基因起始处的588个碱基区存在显著的序列多样性，特别是在有症状的葡萄样品中，MP基因存在提前终止密码子，从而产生了毒力较强的分离物，引起严重症状。为进一步明确GPGV的致病性，研究者构建了侵染性克隆，通过农杆菌浸染方式接种葡萄，出现了与田间自然感染植株相同的症状，进一步证明了GPGV与症状的关系，接种的葡萄4-5个月后会发生隐症现象。植株体内硼元素的平衡在减轻症状中起到一定作用。

  2016年，我国首次报道了GPGV，检测的36个葡萄样品中15个为阳性，其中10个样品表现褪绿花叶症状。将5个感染GPGV的葡萄样品（仅1个表现褪绿花叶症状）嫁接传毒至健康贝达葡萄上，结果均表现明显的褪绿花叶症状，表明贝达葡萄对GPGV较为敏感。2018年，采用 RT-PCR方法对采自15个省（市）自治区的 195 个葡萄样品进行检测，GPGV检出率为28.2%。

  2.3 葡萄浆果内坏死病毒

  日本于1997年最先报道葡萄浆果内坏死病毒（grapevine berry inner necrosis virus, GINV）。GINV被认为是葡萄浆果内坏死病（最早称花叶病）的病原，该病于1984年在日本巨峰葡萄上首次发现，在当时的日本山梨县葡萄园中造成严重危害。敏感品种（巨峰、先锋、立川无核、康拜尔早生等）长势减弱，春季萌芽延迟，并表现茎内坏死、短节、叶片褪绿、果粒变小，果外变色，果内坏死等症状。GINV属发状病毒属（Trichovirus）的成员，病毒粒子大小为740×12 nm，基因组全长为722 9 nt，由3个开放阅读框组成，分别编码复制酶（RP）, 移动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP）。目前已报道3个GINV中国分离物的基因组全长序列。基于MP和CP的遗传进化分析结果显示，中国和日本GINV分离物可分为3组，其中中国分离物主要分在组群1和组群2，日本分离物位于组群3。GINV在田间可通过瘿螨进行传播[41]。

  Fan等（2016）对表现症状（褪绿斑驳和环斑）和无症状的贝达进行小RNA测序，结果，无症状植株中仅检测到2种类病毒（GYSVd1和HSVd），而在表现环斑症状的植株中检测到GINV和HSVd，推测GINV与贝达褪绿斑驳和环斑症状发生相关。后续对我国15个省（市）自治区的195个葡萄样品进行GINV的RT-PCR检测，带毒率为35.9%；表现明显环斑症状的葡萄，GINV检出率为94.1%。虽然将GINV嫁接传毒至健康贝达上会起引起环斑症状，但仍不能完成柯赫氏法则验证。对植物病毒而言，侵染性克隆是完成柯赫氏法则第三条规则的有效方法。为此，我们构建了GINV侵染性克隆，进一步确定了GINV能够引起明显的葡萄环斑症状。

  2.4 葡萄蚕豆萎蔫病毒

  葡萄蚕豆萎蔫病毒（grapevine fabavirus，GFabV）是2016年从日本鲜食葡萄上鉴定出的新病毒，中国、韩国、美国等也有报道。GFabV属于伴生豇豆病毒科（Secoviridae）蚕豆萎蔫病毒属（Fabavirus）成员，其基因组由RNA1和RNA2两条正义单链组成。GFabV基因组变异较大，基于RNA1和RNA2多聚蛋白的部分核苷酸序列系统进化树分析表明，中国和国外GFabV分离物可划分为5个种群，中国分离物归属于其中的3个种群。日本学者基于RNA1基因组序列将GFabV分离物划分为4个种群。目前，中国已获得了3个具有明显差异的GFabV基因组全长序列。

  2017年，采用小RNA测序技术，我国首次从表现叶片褪绿斑驳及畸形症状的‘贝达’葡萄上检测到GFabV，通过嫁接传毒的方法，明确了该病毒与‘贝达’病毒病症状的相关性。我国‘阳光玫瑰’病毒病普遍发生，表现叶片变小、褪绿斑驳、畸形等症状，但均未检测到GFLV。2019年，我们采用小RNA测序技术，对表现和不表现症状的阳光玫瑰进行病毒鉴定，发现GFabV在感病阳光玫瑰中检出率达88.2%，明显高于其它病毒，因此推测GFabV是引起阳光玫瑰病毒病的关键病原。日本保存的阳光玫瑰无病毒原种不携带病毒和类病毒，但母本树（原种嫁接到5BB砧木上）携带GFabV、葡萄双生病毒A、啤酒花矮化类病毒和葡萄黄斑类病毒1。韩国学者也在葡萄上检测到GFabV，带毒的‘阳光玫瑰’葡萄表现叶片褪绿和畸形症状。

  3.展望

  葡萄扇叶衰退病在我国葡萄产区发生普遍，曾经认为类似症状均由GFLV引起，近年研究发现，除GFLV外，GINV、GPGV和GFabV也会引起扇叶衰退病症状（叶片畸形、黄斑、环斑、黄化），且检出率显著高于GFLV。通过侵染性克隆构建（GINV）、嫁接传毒（GPGV、GFabV）等试验研究，证明GINV、GPGV、GFabV与我国葡萄扇叶衰退病相关。今后应加强GINV、GPGV、GFabV的致病性及传播途径研究，研发高效的病毒检测和脱除技术，建立规范的葡萄脱毒种苗培育体系，为我国葡萄产业健康发展提供苗木保障。