济南综合试验站
吴玉森 陈迎春 李勃
香味是衡量葡萄果实品质的重要指标之一，果实品质还受多种植物生长调节剂的调控。其中，赤霉素（Gibberellins, GA3）和氯吡脲（CPPU, [forchlorfenuron, N-(2-Chloro-4pyridinyl-N-phenylurea]）应用最为广泛。GA3具有诱导无核、保花保果和促进膨大等作用。CPPU是一种人工合成的植物生长调节剂，低浓度CPPU具有保花保果和促进果实发育作用。除单独外施外，CPPU还可与GA3等生长调节剂共施提高果实品质。鲜食葡萄外施GA3和CPPU的最初目的是诱导无核和促进膨大，影响香气物质。然而，两者对葡萄果实香气物质的调控还不清楚。为此，本研究系统探讨了两者对香味品质的影响。
1 材料与方法
以阳光玫瑰果实为试材。共设8个样本组（7个处理组和1个对照组），开花前果穗整形。为诱导无核，盛花期4个样本组分别用25 ppm GA3蘸果穗处理；另外4个样本组用纯水处理做对照。花后12天，有核组和无核组的4个样本组分别用纯水、5 ppm CPPU、25 ppm GA3和5 ppm CPPU+25 ppm GA3蘸果穗处理。其中，有核组4个处理依次用N-N、N-C、N-G和N-G+C表示，而无核组4个处理依次用G-N、G-C、G-G和G-G+C表示；具体处理见图1。
1.3 基本指标的测定
每个品种从4穗果穗上、中、下部位各选取3粒，共36粒，用游标卡尺测定果实径、横径。
1.4 香气物质的测定
参照课题组建立固相微萃取技术并结合气质联用仪完成。
1.5 统计分析
分别用T检验和单因素方差分析（ANOVA）比较差异显著性。其他分析用R完成。
2 结果与分析
2.1 果实基本指标与TSS成熟期
盛花期外施GA3能显著改变果型指数（图2a, c），其中，各时期无核组果型指数及纵径均显著大于对应有核组。例如：相比有核组，4个无核处理组15.4wpf果实纵径和果形指数分别平均提高了2.60 mm和0.15。无核和有核组中，花后应用调节剂分别通过提高果实横、纵径来影响果型指数，如相比对照（G-N），无核组G-G、G-C和G-G+C横径均显著提高。大多数时期内，生长调节剂能降低果实TA，提高TSS、糖酸比和pH。其中，成熟期N-N、G-G和G-G+C的TSS分别为19.4和19.6、19.31 °Brix，显著大于其他组；而成熟期N-C、N-G+C和G-G+C组单果重分别为12.98、13.13和13.14 g，显著高于其他5种处理（图2b）。
对比发现，N-C、N-G、N-G+C和G-C处理的15.4和14wpf之间的4项指标变化幅度较小，均小于10 %，显著小于N-N的变化（其糖、酸及其比值变化幅度分别为11.52、20.83和40.57%）。因此，上述4种处理促进果实早熟。相比15.4wpf，除N-G+C外，尽管其他7个处理的后熟果实（16.9wpf）TSS和糖酸比均显著提高（幅度大于10%），但TSS均高于20 oBrix，如G-G的TSS和糖酸比均提高了22.75%；而其TSS高达24.1 °Brix。阳光玫瑰果实最佳TSS在15-20 °Brix之间。因此，虽然这7个处理组TSS进一步提高，但不建议延后采摘。N-G+C组TSS尽管未超过20 oBrix，但其增幅小于10%。因此，N-C、N-G、N-G+C和G-C组促进果实早熟；其他处理组成熟期与N-N一致。
2.2 植物生长调节剂对果实香气物质的影响
8种样本游离态化合物均含有7类物质，而结合态缺少C13组分。比较发现，各处理间组分种类差异很小，尽管组分种类在某些处理间存在一些差异，但差异仅存在个别时期的个别样本。上述结果表明，果实香气物质种类主要受时期调控，受GA3和CPPU影响很小。
2.2.1 植物生长调节剂对果实香气物质含量的影响
果实香气物质以C6、酯和萜类为主。对4对样本（N+N/G+N、N+G/G+G、N+C/G+C和N+GC/G+GC）果实化合物含量进行T检验，各时期4对样本分别有3-39种差异物，其中，萜类为主要组分。盛花期GA3产生的差异物较少，4对处理组分别仅有3、2、0和6种上调组分；7、1、8和1种下调组分，除6-甲基-5-庚稀-2-醇（Sulcatol）外，其他下调组分均为萜类。
对无核和有核组化合物进行方差分析，各处理组间分别有53-65种组分被调控，其中，28%-54%（15-33种）组分被持续调控，主要为萜和C6类组分（表1）。无核组中，相比对照组（G-N），G-G、G-C和G-G+C处理分别有18、18和23种上调物，其中，萜类分别占66.7、57.9和48%；而仅有1种下调物（G-G+C）。同样，有核组中，相比N-N，N-G、N-C和N-G+C处理分别含有12、25和19种上调物，其中，萜类分别占50、52和36.8%；而没有下调物。上述结果表明，花后外施生长调节剂能显著提高香气组分含量。进一步分析（图3）发现，无核组中，大部分上调物（14种，52%）同时被3种处理调控，包括2种C6、1种醛、10种萜和β-大马士酮；而1、2和5种化合物分别仅受GA3、CPPU和GA3+CPPU调控。有核组中，仅有11种（37%）组分同时被3种处理调控，包括2种C6、1种酯和醛，5种萜和2种C13，除了水杨酸甲酯和紫罗兰酮外，其他9种组分同时存在于无核组共同调控组分中；而0、10（33%）（6种萜）和5种组分分别仅受GA3、CPPU和GA3+CPPU调控。
无核组中，3种处理间共形成20种差异物（表1）。G-G/G-C、G-G/G-G+C和G-C/G-G+C之间分别有9、15和10种差异组分，其中，在G-G/G-C中，前者 5种差异物含量高于后者，其他4种组分则相反；11和8种差异物在G-G+C中含量更高，分别显著高于G-G和G-C，其中7种组分为共同差异物，包括1种醇、酯、C13、2种萜和醛。而在剩余13种组分中，2种物质却没有表现出这种效果，如尽管G-G+C的(反)-2-己烯醛含量显著高于G-C，但却和G-G处理没有差异。有核组中，3种处理间共形成25种差异物，G-G/G-C、G-G/G-G+C和G-C/G-G+C之间分别有19、9和13种差异物（表1），大部分组分分别在G-C（18）、G-G+C（9）和G-C（11）中含量更高，因此，大部分差异物在G-C中最高，其次为G-G+C，而最小者为G-G。G-C处理的2种C6组分、1种醇和7种萜类含量同时显著高于G-G和G-G+C；而仅3种组分含量显著低于G或G+C。此外，G-G+C处理的4种萜等9种组分含量显著高于G-G或G-G+C。
上述结果表明，GA3和CPPU主要通过调控萜类和C6组分的合成来改变香气含量，其中，盛花期GA3影响较小，花后处理影响较大。相比对照，花后6种处理均显著上调大部分差异物，其中，无核组中，G-G+C处理含量最高；而有核组中G-C处理最高，其次为G-G+C，而最小者为G-G。
2.2.2 植物生长调节剂对香气化合物转化的影响
为了观测GA3和CPPU对游离态和结合态组分间转化的影响，我们分析了各类游离态组分含量所占总量比例。比对发现，各处理组各大类游离态组分所占比例与N-N差异较小，且差异仅发生在个别时期。为了观测具体组分的转化情况，对各组分游离态比例T检验和方差分析。T检验表明，尽管4种盛花期GA3处理产生18-29种差异物，但只有香叶醇被持续调控。同样，方差分析表明，花后GA3和CPPU处理共产生16-26种差异物，仅有(顺)-氧化玫瑰和己醇被持续调控。上述结果表明，GA3和CPPU处理对果实化合物转化影响较小。
2.2.3 植物生长调节剂对游离态和结合态化合物含量的影响
GA3和CPPU对果实游离态和结合态组分含量的调控与总量相似，盛花期GA3处理影响较小，花后生长调节剂处理的差异物主要以上调为主，无核和有核组中分别以G-G+C和G-C处理组分含量最高。其中，无核组中，相比对照（G-N），G-G、G-C和G-G+C处理游离态组分分别具有12、17和18种上调物，其中，萜类分别占50、35.3和44.4%；而仅有(反)-3-己烯醇1种上调物（表6-1）。大部分上调物（11种，52%）同时被3种处理上调（图3），包括2种C6（(顺)-2-己烯醛和(反)-2-己烯醛）、1种醇和醛、6种萜和β-大马士酮。对3种处理比较，G/C、G/G+C和C/G+C间分别有9、16和5种差异物，而大部分组分分别在C（8）、G+C（13）和G+C（4）中含量更高。有核组中，3种处理各产生6、16和17种上调物，萜类分别占33.3、43.3和41.2%；只有一种下调物（(反)-2-己烯醇）（N-G）。上调物中，6种组分被同时调控（图3），包括C6（(顺)-2-己烯醛和(反)-2-己烯醛）、萜和C13-降异戊二烯类各2种。除了β-紫罗兰酮外，其他组分均为无核组共同调控组分。3种处理间形成14种调控物，其中，G/C、G/G+C和C/G+C之间分别有11、7和8种差异物，而大部分组分分别在C（10）、G+C（7）和C（6）中含量更高。
对于结合态组分（表1），无核组中，相比对照组，3种处理分别具有14、12和13种上调物，其中，萜类分别占64.3、75和61.5%。其中，8种组分（(反)-2-己烯醛和7种萜）为三者共同调控物（图3）；而没有下调物。 此外，2、1和2种组分分别仅受3种处理单独上调。有核组中，3种处理分别有8、19和7种上调组分，其中，萜类分别占87.5、63.2和71.4%。无核组中，3种处理间结合态组分含量差异不大，两两之间仅产生4种差异物。然而，有核组中，N+C处理有13和10种组分含量分别显著高于N-G和N-G+C，主要为萜类，其中，有8种共同组分（图3）；而N+G和N+GC间仅具有3种差异物。
2.2.4 植物生长调节剂对果实香气化合物浓度的影响
盛花期GA3处理对组分浓度的影响较小。4种处理组分别仅有4、0和3种上调组分；6、0、8和5种下调组分。方差分析表明，果实发育时期内，有47-58种组分被调控，其中，23%-39%的组分被持续调控，主要为萜和C6组分。相比对照（G-N），无核组中3种处理分别有11、10和14种上调物，萜类分别占81.8、90和57.1%，有6种共同调控物（图3）；仅有0、2和2种下调物。有核组中，3种处理则分别产生4、14和11种上调物，萜类分别占100、71.4和63.6%；仅有2、0和0种下调物。无核组中，3种处理间共形成13种差异物，其中，G-G/G-C、G-G/G-G+C和G-C/G-G+C间分别有8、8和6种差异物，但3种处理之间差距较小，如G-G/G-C相比，前者 4种差异物浓度高于后者，而其他4种组分表现相反。有核组中，N-G/N-C、N-G/N-G+C和N-C/N-G+C间分别有9、4和7种差异物，在N-C/N-G+C中，前者4种萜类组分浓度高于后者，其他3种组分则相反；在其他2对比较中，N-C的8种（(反)-2-己烯醛和7种萜）和N-G+C的4种差异物浓度分别显著高于N-G。上述结果表明，GA3和CPPU调控香气物质浓度趋势与调控含量结果相似，但各处理间差异组分数量减少。
对游离态组分分析发现，相比对照组，无核组的3种处理分别具有3、4和7种组分被上调，而仅有0、1和1种组分下调。有核组中，3种处理各产生1、6和7种上调和2、0、0种下调物，因此，花后单独GA3处理影响很小，而G-G+C处理显著上调，影响最大。无核组中，3种处理之间共形成11种持续调控物，其中，G-G/G-C、G-G/G-G+C和G-C/G-G+C之间分别有7、9和5种持续差异物，而部分组分分别在G-G（3）、G-G（5）和G-C（1）中浓度更高。有核组中，3种处理之间共形成5种持续调控物，其中，G/C、G/G+C和C/G+C之间仅具有3种持续差异物。
对结合态组分分析发现，无核组中，相比对照组，3种处理分别具有9、8和9种上调物，其中，6种萜类组分为三者共同调控物（图3）；而仅脱氢芳樟醇（G-G+C）为下调物。 此外，2种组分分别仅受G-G+C单独上调（附表6-12）。有核组中，3种处理也仅产生4、9和5种持续上调物，仅香叶酸（N-G）下调。在无核组中，3种处理之间仅水杨酸甲酯和香叶酸2种组分，差异很小。然而，有核组中，N-C处理有5和4种组分分别显著持续高于N-G和N-G+C；此外，N-G+C还有2种组分显著高于N-C。而N-G和N-G+C间仅具有1种差异组分。
2.2.5 植物生长调节剂对成熟期游离态组分浓度的影响
对各处理最后3个时期的游离态总浓度分别比较（图4），结果表明G-N和N-G组的16.9wpf组分浓度分别显著大于各自其他时期；G-G+C和N-C处理则在14wpf化合物浓度最高；而其他处理均在15.4wpf浓度最高。对各处理的最高浓度比较，发现G-N和N-G+C处理的最高浓度分别为4844.3和4315.2 μg/kg，显著大于其他处理组。
2.3 果实香气化合物间及与基本指标间的相互关系
2.3.1 果实香气化合物间的相关分析
以8个时期果实化合物总含量为数据，进行化合物间的相关分析，8种处理分别形成2701-3081对相关对数。生长调节剂对组分间显著相关对数影响较小。其中，4种盛花期GA3处理与各自对照间分别有596-683对共同相关对数，占57.6-78.2%。无核组中，4种样本共有448对相同相关对数，而3种处理与对照间分别有612、632和618对共同对数，占各自相关对数的64.2-72%；无核组中，4种样本共有417对相同相关对数，而3种处理与对照间分别有660、621和571对共同对数，占各自相关对数的60.2-60.5%。
2.3.2 基本指标与香气组分的相互关系
为了弄清果实发育中香气物质与基本指标间的相互关系，进一步分析了两者之间的相关性。8种指标中，香气物质与果形指数大都不相关，但与其他7种指标显著相关。对与这7种指标显著相关的香气组分分为2类：（1）和TA显著负相关，且和其他6种指标正相关；（2）仅和其他6种指标正相关（图5）。结果发现，GA3和CPPU处理对第二类组分影响较大。其中，8种处理分别含有30-40种第一类组分，无核和有核组的4组处理分别有24和20种共同组分，占总双向指标组分50-80%。相比对照，4对GA3处理组分别有23-31种共同组分，占62.5-83.4%。进一步比较发现，17种组分为8种处理共有（图5）。各处理分别含有6-15种第二类组分，但无核和有核4组处理分别仅有1种共同组分；而4种盛花期处理组分别有1-6种共同组分，但仅占该类组分的7.7-50%。
3 讨论
3.1 植物生长调节剂对果实香气化合物的调控
3.1.1 GA3和CPPU均促进链状单萜和(反)-2-己烯醛的积累，两者具有协同效果。
本研究通过盛花期外施GA3来诱导无核，花后12天外施GA3和CPPU促进果实膨大。无核组中，相比缺少GA3的无核果实（G-N），G-G和G-C处理分别有18和19种上调物，但两者差异较小，15种物质为共同组分，包括10种萜类；而没有下调物（表1，图3）。这说明GA3和CPPU效果相似，均显著提高果实萜类含量。然而，G-G+C组产生更多的上调物（23种），除了18种存在于G-G和G-C处理的上调物外，还产生5种新差异物。此外，G-G+C有11和8种组分含量分别显著高于G-G和G-C，而仅有4和2种组分分别低于两者，这说明GA3和CPPU具有协同效应，两者共施可进一步提高香气物质含量。
与对照G-N相比，G-G、G-C和G-G+C具有14种共同上调物，包括(顺)-2-己烯醛、(反)-2-己烯醛、苯甲醛、β-大马士酮和10种萜（图3），其中，(反)-2-己烯醛是鲜食葡萄主要C6化合物之一，其含量显著高于(顺)-2-己烯醛，如各处理成熟期的前者含量是后者的13-48倍。(反)-2-己烯醛来源于LOX途径，由亚油酸分解后经顺-3-己烯醛异构化而来，而其他途径的己醛、己醇和(顺)-3-己烯醛和(顺)-3-己烯醇等产物和(反)-2-己烯醛下游产物(反)-2-己烯醇含量并无差异，因此，GA3和CPPU主要通过上调异构酶活性来提高其含量。根据结构，单萜分为链状和环状单萜，前者由香叶基阳离子或里那基阳离子催化合成；而后者由α-萜品基阳离子催化产生。在上调的10种萜类中，除萜品油烯和α-萜品醇外，其他萜类均为链状单萜，这说明GA3和CPPU主要促进了链状单萜的积累。
同样，有核组中，由于N-N果实内源GA3的原因，花后外施25 ppm GA3（N-G）仅含有12种上调物，数量小于25 ppm GA3产生的18种。而N-C（内源GA3+CPPU）和N-GC（外源25 ppm+内源GA3+CPPU）则分别因CPPU结合GA3进一步促进香气物质积累而产生更多的上调组分（25种和19种），除芳樟醇外，两者包括N-G处理产生的所有差异组分。N-C和N-GC分别有18和9种组分含量显著高于N-G，而仅脱氢芳樟醇在N-G中更高的结果也进一步验证了GA3和CPPU具有协同效应。进一步比较发现，N-C组分含量高于N-GC，其中前者11种组分含量显著后者，而仅有2种组分呈相反趋势，这表明在与CPPU搭配下，内源和外施的GA3浓度已因浓度过高对香气物质的积累产生一定程度的抑制作用。毕竟，浓度过高的外源激素会产生副作用，如花后过高的GA3会导致Cros colman葡萄糖组分含量下降。
3.1.2 膨大稀释大幅度降低果实香气化合物的含量差异
膨大作用调控对花后生长调节剂处理效果影响很大，相比含量差异物，浓度差异物种类和差异幅度均大幅下降（图6b）。其中，无核组3种处理分别有11、10和14种浓度差异组分高于对照（G-N），种类分别仅占含量差异物数量的52.6-61.1%；而有核组3种处理则有4、14和11种差异物，仅占33.3-57.9%。进一步分析发现，浓度差异物均包括在含量差异物中，而缺失的化合物主要是非萜类组分，这导致6种处理中萜类差异物比例提高到57.1-100% 之间，而原始含量的萜类差异物比例仅为36.8%-66.7%。这说明处理组的非萜类含量差异物与对照间含量差异较小，经膨大稀释后浓度缩小到不显著范围。尽管调节剂对组分转化影响很小，但由于游离态和结合态主要以C6和萜类为主，导致两者萜类含量差异物比例分别下降（33.3-50%）和上升（61.5-87.5%）。游离态差异物中萜类比例小于结合态，导致游离态经稀释后的浓度差异物（非萜类）数量下降更多，如结合态花后6种处理的浓度差异物占含量差异物种类的47.4-71.4%；而游离态则仅占16.7-41.7%。其中，相比各自对照，G-G和N-G处理游离态组分分别仅有3和1种浓度差异物；而差异最大者，相比各自对照，G-GC和N-GC分别仅有7种差异组分，这表明经膨大稀释后GA3和CPPU处理对游离态组分浓度的影响变得很小。
3.2 果实增产和成熟期的筛选
GA3和CPPU对葡萄果实大小、糖酸等品质产生显著影响，但具体效果具有品种特异性。本研究发现，N-C、N-G+C和G-G+C处理的成熟期单果重显著高于其他5种处理。无核化一直是鲜食葡萄的目标，因此，从增产角度来讲，G-G+C处理为阳光玫瑰的最佳选择。此外，成熟期N-N、G-G和G-G+C处理的TSS数值显著高于其他处理组，因此，G-G+C处理是增产和提高果实TSS品质的最佳选择。尽管G-G+C处理是增产和提高TSS的最佳选择，但G-N和N-G+C处理却为香气浓度最高处理组。对于G-G+C处理，尽管其香气在14wpf成熟，但香气物质浓度在成熟期并没有下降（图4），因此，建议该处理在15.4wpf采摘。
3.3 果实成熟的香气指标
果实成熟是TSS、TA、糖酸比和果实大小等基本指标的综合表现。确定适宜采收期是提高果实品质的重要措施之一。尽管葡萄果实品质由糖、酸和香味共同决定，但相比香味，糖酸品质为衡量鲜食葡萄成熟的首要指标。香气物质与TSS等基本指标的积累不能兼顾（图4），并不是所有香气组分与糖酸指标共同变化，因此，弄清果实成熟的标志香气物质对于确定采收期具有重要意义。少数研究报道了单一样本（处理）香气组分与TSS的关系，但结果缺少环境因素对香气物质与基本指标间关系的考验。由于GA3和CPPU可以显著改变果实大小、TSS和TA等指标，因此，本文系统分析了8种样本间整个发育期内基本指标和香气组分的关系。随着果实成熟，TSS、PH、糖酸比、单果重、纵经、横经指标逐渐增加，而TA逐渐下降，即TSS等6种指标数值越大，TA数值越小，果实成熟度越好。为了更全面、准确的与果实成熟相关连，本研究把香气组分与更多的指标关联，并分为单向成熟和双向成熟组分。但双向成熟组分则受激素影响较小，更保守，其中，17种组分是8种处理的共同双向成熟组分，包括2种C6、4种醇和10种萜（图5）。其中，在各处理中，这些组分大都同时与TSS、pH、糖酸比、单果重、纵经和横径正相关，且与TA负相关，如在G-N处理中，15种组分均满足上述要求。因此，这17种物质含量可作为阳光玫瑰果实成熟的判断标志。
4 结论
GA3和CPPU显著调控果实大小、糖酸和香气品质。G-G+C处理是膨大增产和提高糖度的最优选择，但糖酸和香气品质并不能兼顾，17种香气物质可作为判断果实成熟的标志组分。GA3和CPPU 表现相似，均促进链状单萜和(反)-2-己烯醛的积累，两者具有协同效应，共施可进一步提高化合物含量，但GA3浓度过高会起到一定程度的抑制作用。