元谋综合试验站
杜鸿燕 杨顺林 陆晓英 郭淑萍 王玉倩
摘要：为明确常见杀菌剂及生防菌剂处理对葡萄白粉病发生及葡萄叶际微生物多样性的影响，进一步预测叶际微生物功能，采用五点取样法调查田间葡萄白粉病害，以Illumina高通量测序技术结合生物信息学分析了杀菌剂及生防菌剂处理与对照处理的葡萄叶际微生物群落多样性差异，并结合PICRUSt2对微生物功能进行预测。结果表明，施用混合菌剂能显著降低白粉病的发生。施用混合菌剂处理后葡萄叶际细菌群落Chao1指数及Shannon指数均下降，分别下降了50%、48%；叶际真菌群落Chao1指数降低42%，Shannon指数增加了4%。在门水平上，农药处理的优势细菌门为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、蓝细菌门和拟杆菌门，优势真菌门为子囊菌门和担子菌门，在属水平上，农药处理后，相对丰度显著增加的细菌有芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属等，显著增加的真菌有曲霉属等。葡萄叶际微生物群落功能预测，共评估了489条MetaCyc途径，以P值＜0.05，倍数变化Fold Change(FC)＞3为进行筛选，共得到49条相关途径，其中有2条相关途径显著上调，47条显著下调，主要与葡萄核酸代谢、光呼吸、叶绿素、维生素合成等功能有关。
关键词：葡萄；农药处理；微生物多样性；葡萄白粉病
随着我国葡萄商品化种植的不断发展，葡萄种植趋向集约化。云南省由于其生态条件适宜，年平均气温在10-23℃间，降雨充足，加之独特的农业科技创新引领，使云南省鲜食葡萄种植面积及产量不断上升[1] 。截至2019年，云南省鲜食葡萄面积达4万hm2以上，其中露天栽培面积约占80%[2] 。在葡萄种植过程中，葡萄白粉病是流行严重的病害之一，由白粉菌目钩丝壳属的葡萄白粉菌（Uncinula necator (Schw.) Burr.）所引起，感染白粉病后葡萄叶片会出现黄化、脱落甚至停止生长[3] ，随着避雨栽培面积加大，不同产区的白粉病有加重的趋势，使生产遭受巨大损失。
腈菌唑是一种高效、低毒的三唑类杀菌剂，主要通过抑制病原菌麦角甾醇的生物合成发挥作用，具有广谱性[4] 。吡唑醚菌酯，常称百克敏等，是一种含吡唑结构的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，该药有内吸性强、持效期长、广谱高效等特点[5] ，解淀粉芽孢杆菌为有益菌，能通过分泌次生代谢产物破坏病原菌细胞结构，诱导植物产生抗性，增加与植物抗病性相关的酶活性[6] ，常用于葡萄白粉病防治。然而，在使用单一菌剂防治葡萄白粉病时，由于菌剂的广谱性，常产生特异性脱靶作用，对葡萄叶际微生物产生严重影响，因此，在施用农药时结合不同类型药剂并科学合理地混用，加入一些生防菌剂，能增强植物的光合效率，降低有害微生物的数量，为植物增强抗性。
植物的地上部分为统称为叶际，含有大量的细菌、真菌等微生物，微生物不同种群间有着营养竞争、共生、寄生等复杂关系，叶际微生物群落结构的稳定对葡萄抵御病害也有一定作用[7] ，一些与植物抗性有关的有益微生物能在葡萄叶际上定殖或通过与病原物竞争营养以及相互作用的位点[8] ，并通过抗菌化合物发挥抑制作用，干扰病原物释放信号，或诱导植物产生抗性[9] 。有研究发现使用农药后能在科和属水平上降低叶际细菌群落相对丰度，其中与植物生长及营养补充功能有关的菌有明显差异[10] ，频繁使用异菌脲也会对植物叶际及根际微生物群落结构造成显著影响[11] ，但关于施用混合菌剂对葡萄叶际微生物影响的研究暂未报道。由于葡萄叶际环境较为复杂，环境气候因素等均会影响叶际微生物的组成及相对丰度，大部分低丰度菌群难以离体分离培养，PLFA（Phospholipid Fatty Acid）标记等传统研究方法有限，仅仅能够测定微生物生物量等，近年来，研究叶际微生物多样性多采用高通量测序方法，刘利玲[12] 采用基于16SrRNA和ITS1基因的MiSeq高通量测序技术发现青杨雌雄株具有不同的叶际微生物菌群和显著富集的菌群，利用高通量测序技术对有青苔病症和无病症的柑橘叶际真核生物的群落结构组成及多样性及差异进行了研究发现优势门为链形植物门Streptophyta、子囊菌门Ascomycota等[13] 。
目前白粉病以化学防治结合生物防治为主，但长期使用杀菌剂防治白粉病易造成“3R”问题，因此科学规范使用农药对葡萄绿色发展有重要意义，采用Illumina高通量测序技术结合生物信息学对葡萄叶际微生物群落结构及功能进行研究，并在田间进行病害调查，计算病情指数及混合菌剂防效，旨在明确混合菌剂农药对葡萄叶际微生物群落结构及白粉病发生影响，以期为混剂农药研发、合理施用及生防菌的筛选提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试葡萄为近5年内未施用任何农药的‘红地球’品种葡萄。供试药剂主要有40%腈菌唑（myclobutanil）悬浮剂（江苏耘农化工有限公司），25%吡唑醚菌酯（pyraclostrobine）悬浮剂（江苏剑牌农化股份有限公司生产），有益微生物≥10亿个/mL解淀粉芽孢杆菌微生物叶面肥（云南省微生物发酵工程研究中心有限公司）。供试仪器主要有电动农药喷雾器（20 L，潍坊鑫浩德机械有限公司）、医用注射器（山东朱氏药业集团有限公司）、电子分析天平、超净工作台、移液枪（Eppendorf）、高速冷冻离心机（5430 R，Eppendorf Centrifuge）、超低温冰箱（-80℃，海尔生物医疗设备有限公司）、超声波清洗机（SY3100DH，40 KHz，上海声源超声波仪器有限责任公司）、高通量组织破碎仪（Wonbio-96c，上海万柏生物科技有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 试验方法
于2020年7月至9月在云南省昆明市云南农业大学现代科研教学实践中心（103°40' E，25°23' N，海拔1920 m）葡萄基地进行，采用随机区组设计，设置施用混合杀菌剂（SW）处理：（3000倍吡唑醚菌酯+3000倍腈菌唑+100倍解淀粉芽孢杆菌）和施用无菌水（CK）处理，设置每小区面积为10 m×10 m，3个重复，共6个小区，每7 d施药1次，共3次。采用小型喷雾器进行施药，杀菌剂混合方式经田间筛选（杜鸿燕等，2021）。
1.2.2 施药及对照处理样品的采集及样品前处理
于田间第3次施药24 h后取样并进行病害调查，以均匀取样为原则，选择叶片上无雨滴露珠的叶片，每个处理以1.5 m为株距，选择3株长势相似的葡萄，采集朝向一致、大小一致、离地面高度一致、距主干第7-8片的叶片，每种处理6个重复，并将样品编号后保存于50 mL无菌离心管中，立即置于干冰盒中带回实验室。将采集的葡萄叶片样品取出，在无菌超净工作台中按每克10 mL的量加入PBS缓冲液（0.1 mol/L，pH=8.0），超声15 min（40 KHz），涡旋10 s（20℃，200 r/min），重复润洗2次，将各样品2次洗脱液汇总至离心管中，离心（4℃，13000 r/min）10 min，弃上清液，收集沉淀。
1.2.3 葡萄叶际微生物总DNA提取与PCR扩增
将收集的沉淀取出，用Mp Fast DNA ® Kit(6560-200)试剂盒抽提DNA，并用1%的琼脂糖凝胶电泳和Nano Drop 2000检测DNA的提取质量。细菌采用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对V3-V4可变区进行扩增，真菌采用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）/ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）对ITS1区进行PCR扩增，引物为上海美吉生物医药科技有限公司所合成。20 µL扩增体系：4 µL 5×FastPfu 缓冲液、0.4 µL聚合酶FastPfu、2 µL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.8 µL上游引物（5 µmol/L）、0.8 µL下游引物（5 µmol/L）、1 µLDNA模板（10 ng/µL），ddH2O补足至20 µL。PCR扩增程序：95℃预变性3 min，30个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s, 72℃延伸45 s），然后72℃稳定延伸10 min，10℃保存，扩增后的DNA经纯化混匀后送上海美吉生物医药科技有限公司测序，每个处理测定6个样品。
1.2.4 Illumina Miseq测序数据处理及比对
采用使用Fastp软件对原始序列数据进行质控，使用Flash软件进行拼接,使用Uparse软件设置97%相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier算法对每条序列进行物种分类注释，设置比对阈值为70%，与16SrRNA数据库Silva、ITS数据库Unite进行比对。
1.2.5 田间调查
施药前随机对每个处理6棵葡萄树进行调查，每棵调查10个叶片，并根据叶片病害分级标准，记录发病情况，0级：叶面无病斑；1级：病斑面积占整个叶面积的5%以下；3级：病斑面积占整个叶面积的6%-25%；5级：病斑面积占整个叶面积的26%-50%；7级：病斑面积占整个叶面积的51%-75%；9级：病斑面积占整个叶面积的75%以上；并按照下列公式计算病情指数和防治效果[14] 。
病情指数=∑（各级病叶数×各级代表值）/(调查总叶数×最高级代表值)×100
防治效果=（对照病情指数-施药后处理病情指数）/对照病情指数×100%
1.3 数据分析
采用Microsoft Excel 2016进行数据统计，SPSS 17.0和 DPS 7.05进行数据分析，应用Duncan’s
新复极差法对田间试验进行显著性检验，T检验法对葡萄叶际微生物相对丰度进行显著性检验，采用R软件及上海美吉生物科技有限公司云平台制图。
2 结果与分析
2.1 混合菌剂处理对葡萄白粉病的防控作用
在整个病害调查期中，施用混合菌剂处理的葡萄白粉病的病情指数显著降低，尤其在7 d施用第2次药后下降明显，对照的白粉病病情指数不断上升，在14 d后接近100，施第三次药后降低至43。混合菌剂对葡萄白粉病防效在14 d达到最高，对白粉病的防效呈上升趋势（图1）。
2.2 葡萄叶际微生物样品测序质量评估
使用农药混合菌剂和对照处理的葡萄叶际细菌群落总序列数分别为241092和244126条，真菌群落总序列数分别为400657和392167条，细菌、真菌平均片段长度分别为214和263 bp，按照相似度97%对非重复序列进行聚类后共获得细菌1016个、真菌188个OUTs。葡萄叶际细菌及真菌稀释曲线显示，在97%相似度分类水平下，细菌及真菌多样性稀释曲线逐渐趋于饱和稳定，表明测序数据量足够，可以反应葡萄叶际微生物绝大多数物种信息（图2）。
2.3 混合菌剂对葡萄叶际微生物的影响
2.3.1 混合菌剂对葡萄叶际微生物Alpha多样性的影响
不同处理葡萄叶际微生物的alpha多样性指数见表1，施药处理后葡萄叶际的细菌群落Chao1、Ace丰富度指数分别下降147.67、139.55，分别下降了近50%、47%，但无显著差异；Shannon多样性指数降低1.36，约为对照的48%，Simpson多样性指数增加，但差异不显著，说明施用混合菌剂会降低葡萄叶际细菌的多样性和丰富度。
施药后真菌群落Chao1、Ace丰富度指数分别下降14.09、16.65，分别下降了近42%、53%，亦无显著差异。Shannon多样性指数增加0.07，Simpson多样性指数降低，但差异不显著。说明施用混合菌剂会降低葡萄叶际真菌的丰富度，但增加了真菌的多样性（表1）。
2.3.2 混合菌剂对葡萄叶际微生物Beta多样性的影响
基于Bray-Curtis距离算法在OTU水平和属水平进行主坐标分析（Principal Coordinates Analysis，PCoA），在OTU水平及属水平上不同处理的葡萄叶际细菌群落均在坐标轴上有明显距离但又未完全分离，表明两处理之间细菌群落有部分相同的物种，PC1及PC2在各水平上共解释了47.36%、80.41%的微生物结构差异。进一步采用非参数检验法ANOSIM分析得，R=0.32，R=0.25，P＜0.05，即样品的组间差异大于组内差异，表明混合菌剂处理后在OTU水平及属水平上葡萄叶际细菌群落结构差异显著。
在OTU水平及属水平上不同处理的葡萄叶际真菌群落均在坐标轴上完全分离，表明两处理之间真菌群落有明显差异，PC1及PC2在各水平上共解释了66.56%、69.41%的微生物结构差异。进一步采用非参数检验法ANOSIM分析得，R=0.28，R=0.29，P＜0.05，即样品的组间差异大于组内差异，表明混合菌剂处理后在OTU水平及属水平上葡萄叶际真菌群落结构差异显著（图3）。
2.3.3 混合菌剂对葡萄叶际细菌群落结构的影响
将质控后的序列数据在97%相似性水平上进行聚类，共得到1016个细菌OTUs，代表序列经物种注释后被归属于26门、67纲、166目、278科、55＆3属，785种。
在所有测定葡萄样品中，厚壁菌门为丰度最高的细菌门，平均相对丰度达80.95%，其次是变形菌门(8.96%)、放线菌门(3.98%)、蓝细菌门(3.67%)、拟杆菌门(1.15%)，以上细菌门累计相对丰度为98.71%，在不同处理的葡萄中存在差异（P＜0.05）。施药处理葡萄叶际中的厚壁菌门显著增加了36.01%，变形菌门、放线菌门和蓝细菌门显著降低了17.70%、6.70%、7.25%，上述结果表明，施药处理显著增加了葡萄叶际厚壁菌门，显著降低了变形菌门、放线菌门和蓝细菌门。
在属水平上，芽孢杆菌属、嗜冷杆菌属、短小杆菌属、拟杆菌属、梭形杆菌属为葡萄叶际细菌群落中平均相对丰度最高的5个菌属，平均相对丰度分别为53.86%、13.08%、1.66%、1.48%、1%，施药后，芽孢杆菌属、嗜冷杆菌属、拟杆菌属分别增加20.55%、9.44%、2.15%，短小杆菌属、梭形杆菌属分别降低2.39%、1.94%，其余低丰度细菌类群合并为Others，由23.21%降低至2.98%，相对丰度大于0.01%的菌属数量由14个减少至5个。以上结果表明了施药后影响葡萄叶际了大量低丰度细菌类群。在属水平上以P＜0.05对所有样品进行差异物种筛选，共得到6种显著变化的物种，显著下降的分别为：未分类的微杆菌科unclassified_f_Microbacteriaceae、未分类的杆菌纲Akkermansia、微球菌属，显著上升的分别为：未命名物种Alistipes、拟普雷沃菌属、未分类菌属unclassified_c_Bacilli（图4，图6-A）。
2.3.4 混合菌剂对葡萄叶际真菌群落结构的影响
代表序列经物种注释后共得到188个真菌OTUs，物种注释后被归属于5门、17纲、40目、91科、135属，162种。在所有测定葡萄样品中，子囊菌门为丰度最高的门，平均相对丰度达71.66%，其次是担子菌门（27.85%），以上2个细菌门累计相对丰度为99.51%，在不同处理的葡萄中存在显著差异（P＜0.05）。施药处理后葡萄叶际中的子囊菌门相对丰度显著降低了21.42%，担子菌门则增加了15.32%。
在属水平上，白粉菌属、尼克氏酵母属、枝孢菌属、线黑粉酵母属、曲霉菌属为葡萄叶际真菌群落中平均相对丰度最高的5个菌属，平均相对丰度分别为48.77%、20.32%、9.75%，1.69%、1.62%，白粉菌属、枝孢菌属、线黑粉酵母属分别降低了9.09%、15.28%、0.98%，尼克氏酵母属、曲霉菌属分别增加了24.34%、2.53%，其余低丰度细菌类群合并为Others，由16.57%降低至13.80%，相对丰度大于0.01%的菌属数量由6个增加至7个。以上结果表明了施药后影响葡萄叶际了大量低丰度真菌类群。在属水平上以P＜0.05对所有样品进行差异物种筛选，共得到3种显著变化的物种，其中2种属于相对丰度前5的物种，余下1种为显著下降的菌属为隔孢伏革属（图5，图6-B）。
2.4 混合菌剂对叶际微生物功能的影响
采用PICRUSt2模块对葡萄样品进行微生物群落功能预测，在16S扩增子及ITS测序结果中，主要评估了415条和74条MetaCyc途径，对两组葡萄样品进行比较，以P值＜0.05，倍数变化Fold Change(FC)＞3为条件进行筛选，共得到49条相关途径，其中有2条相关途径显著上调，分别为：嘌呤核苷酸降解II（需氧）、Beta-D-葡萄糖醛酸和D-葡萄糖醛酸降解超级通道；47条相关途径显著下调，其中真菌参与的仅有1条下调，为5-氨基咪唑核糖核苷酸的生物合成途径I。选择FC值前15的的显著下调途径进行分析，主要与葡萄的霉菌酸酯生物合成、嘧啶脱氧核糖核苷酸从头生物合成III、磷酸吡哆醛生物合成通道及修复、光呼吸、丙酮酸发酵、、叶绿素a生物合成、苯乙酸降解I（好氧）、嘌呤碱基降解I（厌氧）、苯乙胺降解途径、ADP-L-甘油-&β-D-甘露基庚糖生物合成、噻唑生物合成I、脂质生物合成通路、维生素E生物合成（生育酚）、甘油降解、2-硝基苯甲酸降解有关（图7）。
3 讨论
云南省由于雨季降水量增加、温度上升，果园管理不当、农药的不科学施用等导致葡萄白粉病愈加严重，给生产上造成严重经济损失，化学防治及生物是防治葡萄白粉病最有效的防治措施。目前国内外关于混合菌剂对葡萄白粉病的研究报道较少，多为单一菌剂对葡萄白粉病的防效研究[15] 。在本研究中，混合菌剂对葡萄白粉病表现出了良好的防效，尤其在施用第2次药后防效明显，解淀粉芽孢杆菌在一定程度上控制葡萄白粉病，并能促进葡萄光合作用[16] ，腈菌唑具有较好的持效期，结合吡唑醚菌酯的广谱特性[17] ，从而能有效控制白粉病。
植物的叶片是进行光合作用和能量代谢中心，与植物根际类似，植物叶际存在着大量微生物，微生物多样性越高，对叶际微生物群落结构协调作用越强，叶际微生态系统越稳定[18] 。使用混合菌剂防治葡萄白粉病的同时也会影响葡萄叶际微生物群落结构及多样性，降低有害菌的比例。研究表明[19] ，施用广谱农药能显著降低烟草的叶际细菌群落多样性，李审微等[20] 探究施用生防菌后柑橘叶片的叶际微生物多样性降低。与对照相比，使用农药后杀死了一些主要病原物，特异性脱靶作用也影响了叶际其他微生物。总体上来看，使用农药会不同程度地降低叶际微生物的群落多样性。在本研究中，经过混合菌剂农药处理后的葡萄叶际微生物多样性低于对照处理，这是由于混合菌剂影响了叶际部分微生物，经混合菌剂处理后葡萄叶际微生物的Chao1丰富度指数明显低于对照，细菌Shannon指数降低，而真菌Shannon指数增加，这可能是由于混合菌剂中含有的生防菌剂可作为一些有益菌的营养来源，导致一些微生物相对丰度增加，代表组间差异的PcoA图在OTU及属水平上也证明了两个处理间微生物多样性有明显差异。相比较传统的微生物研究方法，基于Illumina高通量测序能更全面地反映微生物在不同水平上的相对丰度及变化情况，结合生物信息学、人工可控的植物-微生物互作系统等方法的发展，能为未来现代农业中通过调控微生物促进植物健康提供更多依据。
厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、蓝细菌门和拟杆菌门是葡萄叶际的主要细菌菌群，子囊菌门、担子菌门为葡萄叶际主要真菌菌群。使用混合菌剂农药还可以显著影响微生物群落结构，在本研究中，与对照相比，施药处理对厚壁菌门、担子菌门等物种提升丰度最大，但同时降低了变形菌门、放线菌门、蓝细菌门等细菌门、子囊菌门等真菌门的丰度。在属水平上，白粉菌属的相对丰度降低，芽孢杆菌属相对丰度增加，与田间试验结果一致。在主要微生物菌群内，部分微生物可以通过植物及其他微生物之间的相互作用及自身丰度来影响群落结构，并在协调寄主与微生物互作中起到重要作用[21] 。通过微生物功能预测模块分析发现，施用混合菌剂后显著降低了与葡萄磷酸吡哆醛生物合成、光呼吸、丙酮酸发酵、叶绿素a生物合成、苯乙酸降解I、维生素合成等途径相关的微生物数量，增加了与葡萄嘌呤核苷酸降解II（需氧）、Beta-D-葡萄糖醛酸和D-葡萄糖醛酸降解途径相关的微生物数量。
磷酸吡哆醛是维生素B6的辅酶形式，作氨基酸转氨酶、脱羧酶和消旋酶的辅酶，对氨基酸代谢起极重要的作用[22] 。DNA含有合成RNA及蛋白质必需的遗传信息，是植物正常生长发育所需生物大分子。光呼吸是植物为适应环境中O2升高而进化出的一条代谢途径，光呼吸能产生C3植物中70%的H2O2、能清除有毒的代谢中间产物[23] ，具有合成必须氨基酸、参与氮同化、解除植物光抑制、增强植物抵抗生物及非生物胁迫能力等功能[24] ，施药后光呼吸显著下调表明，葡萄叶际某些与光呼吸有关的微生物数量受到农药影响。
叶绿素是植物进行光合作用时必须的催化剂，衡量植物光合性能的指标之一[25] ，苯乙酸等有机酸大量积累会对植物造成严重危害，苯乙酸浓度过高对绿苗分化不利[26] 。本研究中发现，施药后苯乙酸降解及叶绿素合成途径被显著降低，表明一些与苯乙酸降解、叶绿素合成有关的微生物数量被降低。核酸是维持细胞功能和细胞增殖的重要物质基础，核酸代谢对植物正常的生长发育有重要调节作用[27] 。一些微生物能将嘌呤分解成氨及一些有机酸，本研究发现施药后核酸代谢途径被显著下调，表明与核酸代谢有关的微生物可能在农药胁迫下显著下调。脂质和糖类物质，植物细胞中的脂肪为储能物质，磷脂是构成生物膜的成分，对植物生长发育同样有重要作用[28] 。糖类物质是光合作用的主要产物，占植物很大比重，是植物的重要营养物质。施药后脂质及糖的合成相关途径下调，表明农药影响了与植物脂质及糖合成有关的微生物。
施用混合菌剂农药能有效防控葡萄白粉病的发生，但会对葡萄叶际微生物多样性及物种丰度造成一定影响，混合菌剂中的杀菌剂能直接杀死一些微生物，而混合菌剂中的微生物菌剂能增加微生物数量，更好地叶际微生物群落平衡，建议云南省寻甸葡萄基地采用混配方式施用农药，更有利于维护葡萄质量稳定和微生物区系的稳定。具体农药最适浓度及频次以及显著变化的菌属是否与植物某些功能及生物合成有关还需要进一步深入研究。