石家庄综合试验站

  葡萄在世界上分布广泛、栽培历史悠久。葡萄果实既可鲜食又可制干酿酒，广受世人喜爱。但是在生产中，病虫害的发生严重制约了葡萄产业的发展。

  葡萄霜霉病(Grape Downy Mildew)是葡萄的主要病害，目前仍是采用化学杀菌剂防控为主。化学杀菌剂的频繁使用不仅能诱导霜霉菌株产生抗药性，也危害了环境的生态平衡。

  抗病相关基因的发现为抗病育种提供了新思路。大量试验显示基于抗病基因获得的抗病性不能稳定遗传，而感病基因失活却能够使植物获得持久的广谱抗性。通过转录组测序，我们发现感病基因VvDLO2基因在葡萄霜霉菌侵染抗、感材料过程中出现了显著的表达差异，该基因在葡萄中编码DMR6-like oxygenase 2，与拟南芥AtDLO2为同源基因，推测其对葡萄防御霜霉菌侵染具有重要的调控作用。

  1 试验材料与方法

  1.1 试验材料

  试验所用的“玫瑰香”葡萄和“摩尔多瓦”葡萄均定植在河北省农林科学院石家庄果树研究所葡萄试验园连栋冷棚内，篱架栽培，5年生植株。分别选择三株长势中庸的“玫瑰香”葡萄和“摩尔多瓦”葡萄作为试材。

  试验菌种为田间混菌，从葡萄试验园内初显霜霉病病斑的叶片上分离得到，在光照培养箱中培养2d-3d。

  1.2 试验方法

  1.2.1 对前期转录组测序筛选感病基因F6H1（F6H1登录号：100251364）进行生物学分析。

  1.2.2 选择一年生新梢由上往下的第3-5片成熟叶片，每株树选20片，做好标记。

  ①接种葡萄霜霉菌。把培养好的葡萄霜霉菌，制成孢子悬浊液，用移液枪将孢子悬浊液接到叶片背面；

  ②外施茉莉酸甲酯。配置0.1mmol的茉莉酸甲酯（购自上海生工）溶液，用移液枪将溶液接到叶片背面。

  ③对照试验。准备灭菌的ddH2O，用移液枪将无菌水接到叶片背面。

  处理后的叶片套上透明纸袋做好标记。在处理后的0h，1h，3h，5h，15h和24h采样，并用液氮速冻，在-80℃冰箱中保存；采样完成后提取RNA，反转录成cDNA。

  根据VvDLO2和抗病相关基因PR1，E9的序列设计引物，进行荧光定量分析。

  2 结果与分析

  2.1 目的基因的生物学分析

  对感病基因F6H1（F6H1登录号：100251364）进行生物信息学分析，结果显示其氨基酸序列与拟南芥DLO2氨基酸序列的相似度高，编码2-氧代戊二酸Fe(II)依赖性加氧酶，将其命名为VvDLO2。该基因的CDS序列大小为1047bp，共编码348个氨基酸；DLO2蛋白不稳定指数、脂肪系数和总亲水性平均系数分别为42.88，84.77和-0.337，分子质量为39288.51ku，等电点为5.72，表明该蛋白是一种不稳定的亲水性蛋白质；DLO2蛋白二级结构中，随机卷曲、α螺旋、延伸链和β转角所占比例分别为39.66％、38.22％、16.95％和5.17％。

  2.2 表达基因qRT-PCR分析

  对不同处理的玫瑰香和摩尔多瓦中的目的基因进行了实时定量表达分析，结果如图1。在玫瑰香中VvDLO2基因接菌处理后有微弱上调表达1h达到2.69，随后下调，在3h后再次上调表达，至5h时达到最高点23.43，随后降低在15h几乎不表达。在激素处理后VvDLO2基因基本不表达。PR1基因在接菌后的1h和5h都有所上升，之后下降至不表达；在激素处理后表达量升高，在5h达到85.71，之后下降，在15h又迅速回升，在24h达到146.79。E9基因在激素和接菌处理后表达量均明显下调。在摩尔多瓦中VvDLO2基因接菌处理后有明显上调表达1h达到14.42，随后下调，在5h后再次上调表达，至15h时达到最高点19.43，随后降低。在激素处理后VvDLO2基因上调表达1h达到13.06，随后下调，在5h后再次上调表达，在24h达到25.33。PR1基因在激素和接菌处理后表达量均明显下调。E9基因在接菌后的15h上升表达，在24h达到8.95；在激素处理5h后表达量升高，在15h达到4.99之后下降。

  3 结论

  感病基因失活能够使植物获得持久的广谱抗性，感病相关基因的发现为抗病育种提供了新思路。本研究克隆了葡萄的感病基因VvDLO2，CDS序列为1047bp，共编码348个氨基酸。表达分析显示VvDLO2可能参与葡萄霜霉病的抗性调控。本研究为后期揭示葡萄抗病机理、选育抗病种质提供了理论参考。