田萌勃 王军 何非
摘要：葡萄园中丰富的砾石困扰着葡萄种植户。为了研究砾石对葡萄和葡萄酒的影响，我们进行了为期两年的实验。实验收集了果穗区和葡萄树体微气候，通过HPLC-MS和HS/SPME-GC-MS测定了葡萄果实的风味组学。砾石覆盖减少了土壤水分，浅色砾石覆盖（LGC）使反射光增强了7-16%，果穗区的温度提高了2.5℃。深色砾石覆盖（DGC）吸收了13%的太阳辐射，降温了果穗区。DGC促进了葡萄中三羟基取代花色苷和C6/C9化合物的积累，而LGC的葡萄则伴随着更高的黄酮醇。不同处理下葡萄的酚类物质特征是一致的。LGC葡萄的整体香气较低，而DGC有助于削弱温暖年份快速成熟的负面影响。我们的结果显示，砾石覆盖通过土壤和果穗区微气候调节葡萄的质量。
关键词：砾石覆盖；葡萄；微气候；酚类物质；香气物质
地面管理一直是葡萄园管理的一个重要方面，主要可分为清耕和覆盖。清耕会导致行间裸露、土壤侵蚀、土壤有机物和养分含量减少（Gristina et al., 2022），不符合生态农业的概念。覆盖是近年来葡萄园的一种新技术。它根据材料的不同，影响土壤的温度和湿度、果穗区和地面的反射光，从而有针对性地调节葡萄和葡萄酒的质量（Wang et al., 2020）。
目前，有机和无机覆盖这两大类覆盖物已被广泛研究。有机覆盖是指覆盖作物，其材料包括植物秸秆、树叶、草和新梢等（Xi et al., 2011）。覆盖作物对调节葡萄树的微气候，特别是果穗区和根系区的微气候起着至关重要的作用，还具有提高葡萄质量、减少虫害和提高土壤肥力的优点（Beslic et al., 2015; Gloria Saenz-Romo et al., 2019; Xi et al., 2011）。与作物覆盖相比，无机覆盖有更多的材料选择，包括地膜、反光板、遮阳网、碎玻璃、贝壳等（Mejias Barrera, 2012; Nachtergaele et al., 1998; Wang et al., 2020）。
Coventry et al.（2004）表明，反射膜可以调节来自地面的反射光，增加葡萄的可溶性固体和总酚含量。覆盖破损的玻璃内行增加果实区的UV-A、UV-B和光合有效辐射（PAR）水平，并增强葡萄酒中的黑莓、桑葚和黑加仑等黑莓香味（Mejias Barrera, 2012）。上述覆盖物通常是种植者主动选择的，然而，应该关注的是，建立在山脚下或河流旁边的葡萄园通常有大量的砾石，这导致葡萄园被砾石覆盖。以前有报告说，砾石覆盖通常会导致土壤和环境温度的低水平，这将影响葡萄根部的生长和发育（Nachtergaele et al., 1998）。然而，据我们所知，关于砾石覆盖对葡萄和葡萄酒质量影响的研究还没有被调查过。缺乏相关的结果困扰着种植者和研究人员，并因此对葡萄园地面管理的实践提出了挑战。
宁夏贺兰山东麓是中国最重要的葡萄酒产区之一。该地区的土壤以砾质沙土为主，一些葡萄园的沙子含量超过50%（Qi et al., 2019）。频繁的大风天气导致干旱的土壤表面的颗粒流失，导致大量的砾石覆盖在葡萄园上。此外，砾石的颜色各不相同，有些颜色较深，有些较浅。目前还不清楚不同颜色的砾石覆盖是否对葡萄果实有相同的影响，而且缺乏相关的研究，给种植者带来了困惑，不知道是否要清除砾石，以及应该先清除哪种颜色的砾石。
在这些情况下，当前的研究在葡萄园中用浅色和深色的砾石覆盖葡萄树行内，以模拟和放大砾石经常出现的葡萄园环境。我们收集了大气候指标、土壤和果穗区微气候，通过HPLC-QqQ-MS和顶空固相微萃取（HS/SPME）-GC-MS测定了葡萄的风味组学。该研究的目的是调查葡萄园中的砾石覆盖对葡萄质量的影响。
1 材料与方法
1.1 试验地点和材料
连续两年（2018年和2019年）的实验是在位于银川（北纬38.39°-东经105.97°，海拔1266米）的商业葡萄园进行的，该葡萄园位于中国宁夏回族自治区贺兰山东麓地区，名为长城天赋酒庄。研究了2012年种植的自根苗‘赤霞珠’葡萄树。树形为M-VSP，从4月到9月每月滴灌2次，每个生长季的总灌溉水量约为5000-6000 m3/ha。土壤类型为砂质壤土，含有大量的砾石，土壤pH值约为8.7。
1.2 试验设计与样品采集
从花期开始，选择9个相邻的且长势一致的‘赤霞珠’进行实验，排除行首和行尾的三个架空。三个处理如下：（1）对照组（CK），行内清耕。（2）白色砾石覆盖（White），行内覆盖白色或浅色砾石。（3）黑色砾石覆盖（Black），行内由黑色或深色砾石覆盖。砾石覆盖的宽度是以葡萄树为中心的60厘米，连续处理了15棵葡萄树。
在五个发育阶段收集葡萄浆果，即豌豆大小（E-L 33）、转色初期（E-L 35）、100%着色（E-L 36）、成熟中期（E-L 37）和商业收获阶段（E-L 38），以确定理化指标，而酚类和挥发性化合物则在采收期进行。在取样过程中，对每行的15棵葡萄树进行了统一取样，并考虑到了葡萄果穗的曝光面和遮光面。每个重复共收集了300个浆果测定理化指标。在采收期，另外收集了300个浆果，用于测定酚类和挥发性化合物。采样后，葡萄果实用液氮快速冷冻，然后储存在-40℃的冰箱里，直到进一步分析。
1.3 试验方法
葡萄理化指标测定、葡萄果实酚类物质提取、和检测方法，香气物质的提取和检测采用实验室统一方法（Wang et al., 2021）
2 结果与分析
2.1 气象数据和果穗区微气候
整个生长季下的气象数据没有显示出显著差异（表1），只有降雨量有差异，2018年的降雨量几乎是2019年的两倍。以及7月的平均温度，两个年份之间的差异约为1℃。与温度有关的其他指标，如生长季节温度（GST）、日温指数（HI）和生长度日数（GDD）在两个年份没有显示出明显的差异。然而，这些指标的累积模式呈现出两个年份之间的特征（图1）。与过去十年相比，2018年的月平均温度在5月至8月几乎是最高的，这意味着葡萄在2018年遭受了一个温暖的年份。相反，在2019年，温度保持凉爽，没有超过过去十年的平均值，只有在9月，即收获的月份，明显高于2018年的温度。降雨量的趋势也显示出不同年份之间的差异，2018年的7月和8月多雨，而2019年6月的降雨量最高。
关于丛生区从成熟到收获的微气候（图2），白色砾石覆盖物反射光的总辐射量日均比CK高4.63 W/m2，这又导致果穗区的温度平均相差约1℃。然而，在平均温度较低的日子里，主要是阴天或雨天，白色砾石覆盖的果穗区的温度与CK的温度接近。在晴朗的日子里，白色砾石覆盖物和CK之间的温差可以达到约2℃。有趣的是，黑色砾石覆盖减少了反射光和果穗区的温度（图2），这是白色和黑色砾石覆盖之间最显著的差异。这一结果的原因可能是黑色砾石吸收了太阳辐射，因此减少了反射光强度，反过来导致果穗区的温度下降。果穗区的相对湿度（RH）在低RH水平下没有差异，而白色砾石覆盖物在高RH下呈现出较高的数值。这可能是因为覆盖大量的砾石使水难以从表面渗透到土壤中。然而，在黑色砾石覆盖处理中没有发现一致的相对湿度趋势，这可能与砾石的大小和覆盖物的密度不一致有关。
对于根系区的微气候，砾石覆盖的处理显著影响了地下20厘米深处的土壤水分和根系温度。两种砾石覆盖物的土壤水分比CK的土壤水分低19-36%。关于根系的温度水平，白色砾石覆盖物与CK接近，但保持更稳定。黑色砾石覆盖层的根际温度比CK略高。然而，差异没有达到1℃。
总之，白色砾石覆盖物的处理增加了反射光强度和果穗区温度，而黑色砾石覆盖物的效果则相反。此外，两种砾石覆盖物都降低了土壤湿度，对根系区温度的影响有限。
2.2 葡萄果实理化指标
在成熟过程中，对‘赤霞珠’理化参数，包括百果重、总可溶性固体（TSS）、可滴定酸度（TiA）和pH值进行了跟踪。与CK相比，白色砾石覆盖在早期阶段明显促进了葡萄浆果的发育（P < 0.05），特别是在E-L 33和E-L 35，这一点从浆果重量和TSS的快速增加可以看出。然而，这些差异随着葡萄的成熟逐渐减少，在收获时没有发现浆果重量和TSS的显著差异。相反，黑色砾石覆盖的葡萄的浆果重量和TSS保持较低。尽管在2018年的温暖年份，黑色砾石覆盖的收获TSS没有显示出明显的差异，但在平均年份（2019年），它仍然明显低于其他处理。
关于可滴定酸度（TiA）和pH值，在中熟前发现的差异有限。然而，从E-L 37开始，砾石覆盖，特别是白色砾石，显著降低了TiA，增加了pH值。与CK相比，在温暖的年份，黑色砾石覆盖在TiA和pH值方面没有出现明显的差异。
2.3 葡萄果实多酚指标
在用不同砾石覆盖物处理的葡萄皮中共检测到15种单体花青素，包括5种基本糖基化花青素，以及它们的乙酰化和对香豆酰化衍生物（补充表3）。砾石覆盖物在2018年没有影响花青素（Cys）、甲基花青素类（Pns）和对香豆酰化花青素的浓度，而黑色砾石覆盖物明显增加了二甲花翠素类（Mvs）和乙酰化花青素（P < 0.05），这也是葡萄皮中最丰富的花青素成分（图1）。同样的结果也出现在2019年的葡萄中。此外，花翠素类（Dps）和甲基花翠素类（Pts）的花色苷也呈现出明显高于CK葡萄的砾石覆盖水平。当考虑到总的单体花青素时，在所有处理中，黑色砾石覆盖物的浓度最高，
对于黄酮醇，检测到五种黄酮醇及其糖基化衍生物（图1）。槲皮素是葡萄皮中最丰富的黄酮醇，其次是杨梅素、山奈酚和异山奈酚。与CK相比，白色砾石覆盖增强了整体的黄酮醇，尽管有些成分在某些年份并不显著。相反，黑色砾石覆盖物的大部分黄酮醇浓度呈现出低于CK的水平。在当前的研究中，山柰酚的水平在两个年份中呈现出一致的趋势，白色砾石覆盖的水平最高，黑色的最低，这与它们的反射光强度呈正相关。
在两年内测定了葡萄皮和种子中黄烷醇的浓度，黄烷醇中比例最高的是延伸亚单元，其中表儿茶素（EC）的含量最高。而儿茶素（C）被发现在末端单元和游离单元中的含量最高。砾石覆盖对果皮黄烷醇的影响在连续两个年份中保持一致，白色砾石覆盖促进了游离单元和延伸单元的积累，而黑色砾石覆盖与CK相比对黄烷醇有负面作用。在两个年份中没有发现砾石覆盖对末端单元的一致影响，至于种子黄烷醇，白色砾石覆盖仍然是最高水平，但在较温暖的年份没有观察到明显差异。在较冷的年份，黑色砾石覆盖也明显增加了种子黄烷醇，但没有白色砾石覆盖那么有效。我们的研究表明，在较冷的年份，种子黄烷醇更容易受到环境因素的影响。
2.4 葡萄果实香气指标
在葡萄中共检测到89种游离/结合形式的挥发性化合物，这些化合物分为以下几类：降异戊二烯类、萜烯类、C6/C9化合物、苯、酸、高级醇、醛和酮以及酯。在目前的研究中，将每种挥发性化合物的游离和结合形式的浓度加起来，以研究砾石覆盖对葡萄中整体挥发性代谢物的影响。此外，由于几种类型的化合物在发酵过程中的变化，三类葡萄品种香气，包括C6/C9化合物、萜烯类和降异戊二烯类，被特别注意。
在连续两年中，黑色砾石覆盖物明显增强了C6/C9化合物的积累（补充图5），而白色砾石覆盖物的水平最低，尽管在较冷的年份这一点并不明显。C6/C9化合物的差异主要反映在己醛上，其次是（Z）-3-己烯-1-醇和1-己醇。另一种受黑色砾石覆盖影响的挥发性化合物是降异戊二烯类，它在2018年的温暖年份中明显促进。虽然一些游离或结合的成分呈现出明显的差异，但2019年的总降异戊二烯类是最高的，没有明显的差异（P < 0.05）。在总萜烯类化合物中也发现了类似的结果，砾石覆盖物的水平较低，没有明显的差异。
我们的结果突出表明，挥发性化合物高度依赖于年份，因为连续两年的浓度和成分都有很大差异。2019年C6/C9化合物的浓度明显高于2018年，这表明C6/C9化合物的合成更喜欢低温。这与之前关于不同微气候下的葡萄挥发物的报道一致。此外，2018年黑色砾石覆盖物中的C6/C9化合物明显最高，也支持之前的结果。
3 结论
在本研究中，研究了用白色和黑色砾石覆盖内行的‘赤霞珠’葡萄树。收集了大气候指标、果实区和根区的微气候参数。结合葡萄果实成分，我们发现砾石覆盖降低了土壤湿度，并略微提高了地下20厘米处的土壤温度。此外，白色的砾石覆盖物使反射光增强了7-16%，果穗区温度提高了2.5℃，而黑色的覆盖物吸收了13%的太阳辐射，从而冷却了果穗区。
果实区微气候的异质性调节了黑色砾石覆盖的葡萄果实中更多的三羟基取代花色苷和C6/C9化合物的积累，白色砾石覆盖的葡萄中黄酮醇含量明显最高，总体挥发性浓度较低。这些结果表明，田间实践可以改变浆果的组成，从而针对葡萄酒的质量。因此，建议贺兰山东麓地区的种植者在不干扰田间正常操作的情况下可以清除葡萄园中的浅色砾石，以提高葡萄和葡萄酒的质量，而深色砾石可以保留。此外，我们的研究结果为通过葡萄园覆盖对葡萄和葡萄酒成分的微气候影响带来了新的见解。