病毒病防控岗位

范旭东 张宝东 董雅凤 任芳 胡国君 张尊平

  葡萄蚕豆萎蔫病毒（grapevine fabavirus）是2016年美国学者从两个日本鲜食葡萄‘黑色甜菜’（Vitis vinifera L. ‘Black Beet’）和‘长野紫峰’（Vitis vinifera L. ‘Nagano Purple’）上鉴定出的一种葡萄病毒。目前，GFabV已在美国、日本、中国、韩国等国家相继报道。我国于2017年首次在本土葡萄上发现，并初步表明该病毒与‘贝达’葡萄叶片褪绿畸形症状发生相关。随后的研究表明该病毒可能与我国‘阳光玫瑰’病毒病的爆发相关。日本学者Chiaki等研究表明，阳光玫瑰葡萄原种不携带病毒，但嫁接在5BB砧木的母本树携带GFabV，从而造成病毒病的流行。目前，GFabV在我国22个省（市）自治区均有发生，侵染率达48.1%。鉴于该病毒具有较强的致病性，开展相应的防控技术研究十分必要。

  GFabV属于伴生豇豆病毒科（Secoviridae）蚕豆萎蔫病毒属（Fabavirus），其基因组结构与蚕豆萎蔫病毒属病毒类似，由RNA1和RNA2两条正义链组成。我国学者基于GFabV的RNA1和RNA2多聚蛋白的部分核苷酸序列进行了系统进化树分析，将国内外GFabV分离物划分为5个种群，其中，中国分离物归属于其中的3个种群。日本学者基于RNA1基因组序列将GFabV分离物划分为4个种群。目前，GenBank上登录的GFabV全长分离物仅有2个，即日本报道的DWRS和CSM分离物。目前尚未见该病毒中国分离物基因组全序列的相关报道。

  本研究首次测定了两个中国GFabV分离物LN-Beta2和LN_CXZ的全基因组序列，并对其基因组结构及基因序列进行了比较和分析。该研究结果不仅能丰富GFabV种群信息，而且对深入研究其生物学特性具有重要意义。

  1 试验材料

  葡萄样品为辽宁省葫芦岛市兴城市中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心试材保存圃栽植的‘贝达’和‘赤霞珠’葡萄，其中‘贝达’葡萄样品表现为褪绿斑驳、皱缩等，‘赤霞珠’无明显症状。

  2 试验方法

  （1）小RNA测序及分析

  将采集的葡萄叶片通过干冰运输至北京百迈客生物科技有限公司，委托其对叶片组织中的小RNA进行深测序。原始数据过滤、小RNA组装及Blast比对按照已报道的方法进行。

  （2）RNA提取及反转录

  剪取适量的‘贝达’与‘赤霞珠’葡萄品种嫩叶，采用柱式RNA提取法进行总RNA提取。反转录在1.5 ml灭菌离心管中进行，依次加入18.0 μl RNase free water、6 bp Random Primer 2.0 μl、总RNA 10.0 μl，离心混匀，72 ℃金属浴7 min，加入5×M-MLV buffer 10.0 μl、10 mmol/L dNTPs 6.0 μl、200 U/μl M-MLV 逆转录酶1.0 μl、灭菌纯水3.0 μl，37 ℃金属浴10 min，42 ℃金属浴50 min，72 ℃金属浴10 min。合成的cDNA立即用于PCR扩增或-20℃冰箱保存。

  （3）GFabV全长基因组扩增及克隆、测序

  根据小RNA拼接获得的GFabV序列设计引物，分段扩增GFabV全长基因组序列。采用RACE方法对GFabV的5ʹ和3ʹ端非编码序列进行扩增。对PCR扩增获得的目的DNA片段经艾德莱生物公司提供的琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收纯化后，与POTO-T载体室温连接5 min，转入Escherichia coli DH5ɑ感受态细胞，挑取白色单克隆菌进行菌液培养，经PCR验证后获得阳性克隆并提交生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

  （4）序列分析

  利用DNAStar软件进行序列拼接，利用DNA-MAN软件分别对LN_BETA2、LN_CXZ与GenBank中已公布的GFabV其他分离物进行核苷酸和氨基酸序列相似性比较。利用NCBI在线工具CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对获得的GFabV基因组结构进行分析。基于GFabV中国分离物（LN_BETA2、LN_CXZ）与GenBank中已公布的GFabV其他分离物的多聚蛋白（polyprotein）序列，采用MEGA7.0软件构建系统进化树，构建方法是邻接法（neighbor-joining，NJ），置信值（BootStrap）设为1000 。同时利用MEGA7.0软件中的Kimura2-parameter (K2P) 法来计算各组内和组间的遗传距离。采用RDP4程序包对GFabV不同分离物进行重组分析。该程序包包括RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan、3Seq等方式。当4种以上软件支持重组，且P＜1.0×10-6时，该分离物被认为存在“明确”重组。

  3 结果与分析

  2.1 小RNA测序

  对‘贝达’和‘赤霞珠’葡萄样品进行了小RNA深度测序，过滤后的数据（Clean data）中小RNA数量分别为15,794,886和14,315,103。‘贝达’葡萄样品小RNA拼接的contigs中，33个与已报道的GFabV分离物NP的RNA1基因组序列同源性达82.22%-97.78%，覆盖率为59.4%。12个与GFabV分离物NP的RNA2基因组序列同源性达82.69%-89.36%，覆盖率为50%。‘赤霞珠’样品小RNA拼接的contigs中，24个与已报道的GFabV分离物BB的RNA1序列同源性达81.24%-97.22%，覆盖率为68.7%，17个与GFabV分离物NP的RNA2序列同源性为82.76%-96.55%，覆盖率为61.7%。

  2.2 基因组结构分析

  根据‘贝达’和‘赤霞珠’葡萄小RNA拼接获得的GFabV RNA1和RNA2的contigs序列，分别设计引物对GFabV分离物LN-BETA2和LN-CXZ的RNA1和RNA2基因组进行分段PCR扩增，同时采用RACE技术对RNA1和RNA2基因组末端序列进行扩增，最终获得了GFabV分离物LN-BETA2和LN-CXZ的RNA1和RNA2基因组全长序列。已将LN-BETA2和LN-CXZ的RNA1和RNA2基因组全序列提交至GenBank数据库，登录号为MZ327141~MZ327144。

  LN_BETA2 RNA1基因组序列长度为5824 nts，包含一个5574nt长度的开放阅读框（ORF）、编码1857 aa的多聚蛋白，166 nt的5’- untranslated region (UTR )和84 nt的3’-UTR（图1）；LN_CXZ RNA1基因组序列长度为5823 nts，包含一个5574 nt长度的开放阅读框（ORF）、编码长度为1857-aa的多聚蛋白，164nt的5’-UTR和85nt的3’-UTR。参照蚕豆萎蔫病毒属裂解位点的相似性，推测了多聚蛋白的裂解位点，将多聚蛋白分成蛋白酶辅因子（Co-Pro）、NTP结合域（Hel）、基因组连接蛋白（VPg）、蛋白酶（Pro）和RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）。

  LN_BETA2 RNA2基因组序列长度为3132 nts，包含一个2961nt长度的开放阅读框（ORF）、编码987aa的多聚蛋白，84-nt的5’-UTR和83-nt的3’-UTR（图1）；LN_CXZ RNA1基因组序列长度为5823 nts，包含一个5574nt长度的开放阅读框（ORF）、编码1857 aa的多聚蛋白，86nt的5’-UTR和85nt的3’-UTR。参照蚕豆（萎蔫）病毒属裂解位点的相似性，将多聚蛋白分成：运动蛋白（MP）、大外壳蛋白（LCP）和小外壳蛋白（SCP）。

  运用Mfold方法对GFabV中国分离物RNA1和RNA2的5’-UTR二级结构进行预测分析，结果（图2）表明，其RNA1和RNA2的5’-UTR的前20个碱基中形成相似的茎环结构。对其5’-UTR和3’-UTR进行序列比对，结果表明，其RNA1的5’-UTR 1-20位置序列保守。与Comoviruses和Nepoviruses相似，其RNA1和RNA2的5’-UTR富含U（31.76-37.65%），G+C含量较少（33.72-38.41%）。LN_BETA2和LN_CXZ基因组RNA1的5’-UTR中均含有重复序列（GAAUUUG）2和（UUAGA）2，而仅有LN_BETA2中含有重复序列（CCUGUG）2。

  2.3 序列相似性分析

  运用Megalign软件，将LN_BETA2和LN_CXZ分离物的序列与GenBank中其他GFabV分离物的序列进行核苷酸和氨基酸的同源性比对。结果表明，LN_BETA2和LN_CXZ的RNA1基因组polyprotein核苷酸和氨基酸同源性分别为81.7%和94.0%。LN-BETA2编码的Polyprotein、Co-Pro、Hel、VPg、Pro、RdRp其他分离物相比，核苷酸同源性分别为73.4-99.5%、71.2-99.4%、78.7-99.7%、80.7-93.5%、72.5-99.6%、71.2-99.3%，氨基酸同源性分别为85.2-99.6%、75.7-99.6%、93.9-100%、100%、82.9-99.3%、84.4-99.9%。LN-CXZ编码的Polyprotein、Co-Pro、Hel、VPg、Pro、RdRP与其他分离物相比，核苷酸同源性分别为73.5-82.5%、70.9-83.4%、79.2-86.0%、75.6-87.0%、78.2-87.1%、72.6-83.7%，氨基酸同源性分别为85.4-94.7%、75.9-89.8%、94.0-98.9%、100%、86.9-95.9%、84.4-95.4%。

  LN_BETA2和LN_CXZ的RNA2基因组polyprotein核苷酸和氨基酸同源性分别为83.8%和95.3%。LN-BETA2编码的Polyprotein、MP、LCP、SCP与其他分离物相比，核苷酸同源性分别为75.0-83.3%、73.4-88.1%、77.0-99.6%、63.1-99.7%，氨基酸同源性分别为88.2-94.7%、86.2-94.6%、93.9-100%、85.5-99.5%。LN_CXZ编码的Polyprotein、MP、LCP、SCP与其他分离物相比，核苷酸同源性分别为68.2-98.6%、74.7-96.6%、77.3-100.0%、70.7-100.0%，氨基酸同源性分别为78.0-98.7%、85.9-96.8%、94.7-100.0%、79.8-100.0%。

  RDP重组分析结果显示，本研究获得分离物的RNA1和RNA2用七种方法都未检测到重组事件发生，根据RDP分析方法的判断标准，本研究获得的分离物无重组事件发生，不属于重组病毒。

  2.4 各分离物系统进化树分析

  以GFabV中国分离物（LN_BETA2和LN_CXZ）RNA1和其他GFabV分离物RNA1的多聚蛋白核苷酸序列构建系统发育树，结果表明，GFabV不同分离物在进化树上形成3个分支，其中，LN_BETA2和LN_BETA组成由种群3；LN_CXZ独立出来一个分支，暂未分组（图3A）。以GFabV中国分离物（LN_BETA2和LN_CXZ）RNA2和其他GFabV分离物RNA2的多聚蛋白核苷酸序列构建系统发育树，结果表明，GFabV不同分离物在进化树上形成6个分支，其中， LN_BETA2和LN_BETA组成种群3，由LN_CXZ1与TJ-Cas组成种群5（图3B），

  为验证分组结果的可靠性，对组内和组间的遗传距离进行了分析。结果表明，RNA1中I组的组内遗传距离较大，为0.149，II、III组的组内遗传距离为0.008、0.005。比较各组组内遗传距离和组间遗传距离发现，组间遗传距离远大于组内遗传距离，说明该分组结果是可靠的；结果表明RNA2中I组的组内遗传距离较大，为0.133，II、III、IV、V、VI组的组内遗传距离分别为0.013、0.003、0.016、0.001、0.011。比较各组组内遗传距离和组间遗传距离发现，组间遗传距离远大于组内遗传距离，说明该分组结果是可靠的。