酿酒葡萄品种改良岗位
摘要：酿酒葡萄种子中含有丰富的酚类活性物质，发酵后的葡萄种子仍是各种生物活性化合物的宝贵来源。以3个酿酒红葡萄品种为试验材料，测定比较葡萄发酵前后种子中酚类物质和抗氧化活性，为科学利用发酵后葡萄种子中功能物质提供理论依据。结果表明：不同品种葡萄种子大小及种子中酚类物质含量差异显著，其中马瑟兰葡萄种子酚类物质含量显著最高，发酵后种子中总酚和单宁含量损失量小于其葡萄果实种子中含量的35.98%。赤霞珠葡萄发酵后种子中类黄酮含量为8.51 mg/g，显著高于其他两个葡萄发酵后种子中类黄酮含量。赤霞珠和马瑟兰种子中原花色素物质含量发酵前后差异不显著，品丽珠葡萄种子原花色素物质发酵后仅降低了8.78%。3个酿酒品种发酵后种子DPPH自由基清除率和羟自由基清除率均保持在60.00%以上，表现为较高的抗氧化活性。酚类物质和抗氧化物质间呈正相关关系，其中单宁与DPHH清除率呈极显著正相关性，类黄酮DPHH清除率呈显著正相关性。酿酒葡萄发酵后种子中酚类物质损失量较少，仍具有较高酚类活性物质可以利用。
摘要：酿酒葡萄种子；酚类；抗氧化活性
我国是葡萄种植和葡萄酒生产大国，2021年我国葡萄酒生产量为2.68亿升，葡萄籽作为葡萄酒生产的主要副产品，葡萄籽产出占葡萄酒生产量的10%以上。葡萄种子中含有丰富的单宁、类黄酮、原花色素等酚类化合物，且葡萄种子的富含多种活性物质，具有很高的抗氧化功能，能够有效减少机体的活性氧。相关研究表明，葡萄籽提取物具有抗炎、抗衰老、抗辐射、抗癌等药用效果，具有多重显著的抗氧化功效。红葡萄酒在发酵过程会从葡萄种子提取相关酚类活性物质，以此丰富葡萄酒的风味提高葡萄酒的保健功能。酿酒葡萄赤霞珠较鲜食葡萄巨峰种子中含有较高的原花青素，且DPPH自由基清除能力和还原性高于巨峰鲜食葡萄的种子。葡萄酒中含有大量的生物活性物质，其主要来源包括发酵过程从葡萄种子中提取。葡萄籽含有丰富的黄酮类化合物，该物质在体内和体外均具有抗氧化活性，和抗各种癌症、心血管疾病和几种皮肤疾病的活性密切相关。原花青素能够促进果实的抗氧化能力，增强抗氧化应激诱导抗衰老的能力，通过原花青素处理后荔枝，明显延缓了果皮的褐变和颜色变化，降低了荔枝果实的乙烯产量和呼吸速率，保持了荔枝较长时间的果皮新鲜度。研究发现葡萄种子发酵液可以有效抵御衰老并抑制黑色素生成，具有抗衰、美白效果，且具有良好的安全性。
目前酿酒葡萄发酵后葡萄种子的利用率不高，发酵后种子的处理方式单一，没有合理高效的利用发酵后种子的营养功能。本研究通过对3个酿酒红色品种发酵前后种子中酚类物质及抗氧化活性物质进行比较，分析酿酒葡萄种子在发酵后酚类物质损失率及抗氧化活性物质减低值，阐明酿酒葡萄发酵后种子中可利用的功能物质，为发酵后种子高效利用于食品、医药、化妆品等行业提供理论依据，提高葡萄酒副产品的利用效率。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验材料所用的三个品种赤霞珠（Cabernet Sauvignon，CS）、马瑟兰（Marselan，M）、品丽珠（Cabernet Franc，CF）取之于山西省怡园酒庄，葡萄栽培管理一致，在酒庄采收葡萄时取果实样用于测定品种种子中酚类物质和抗氧化活性物，在酒庄葡萄酒发酵结束后取发酵后种子，分别为发酵后赤霞珠（After fermented Cabernet Sauvignon，AFCS）、发酵后马瑟兰（After fermented Marselan，AFM）、发酵后品丽珠（After fermented Cabernet Franc，AFCF），葡萄酒发酵工艺流程一致。
试验试剂：试验用的试剂分别为福林酚、氢氧化钠、碳酸钠、亚硝酸钠、氯化铝、甲醇、无水乙醇、正丁醇、浓盐酸、过氧化氢、DPPH等药品均为分析纯，生产厂家为国药集团化学试剂有限公司；没食子酸、单宁酸、芦丁、原花色素为色谱醇，生产厂家为北京索莱宝科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 葡萄种子基本指标测定
将果实中种子及酒后种子放置于干燥环境自然阴干后，利用游标卡尺测定种子长宽，分析天平测定种子百粒重，观测判定种子是否有种脐。
1.2.2 葡萄酚类及抗氧化活性物测定
参照酚类及抗氧化成分提取工艺，取1 g葡萄种子于研钵中，倒少许液氮充分研磨后，转入50 mL棕色容量瓶中，加部分70%酒精在超声功率100W提取20 min，过滤后滤渣重复提取，共提取3次，每次料液比为1：16.2（g：mL），合并滤液用70%酒精定容在50 mL棕色容量瓶中，用于酚类及抗氧化活性物测定。
采用Folin-Ciocalteu法测定总酚和单宁含量，用儿茶素和单宁酸等价表示（mg/g）；通过氯化铝比色法测定类黄酮，结果以芦丁等价表示（mg/g）；采用正丁醇-盐酸比色法测定原花色素含量，结果以原花色素等价表示（mg/g）。
参照Liu等方法测定DPPH自由基清除率：将不同浓度的待测酒样加入含有DPPH的甲醇溶液中，得到3 mL的反应体系后振荡混匀，在25 ℃下避光放置半个小时后于波长517 nm下测定其吸光度。
参照Liu等方法测定羟自由基清除率：将不同浓度的待测酒样与FeSO4溶液和水杨酸溶液混合后再加入H2O2溶液，得到6 mL的反应体系后振荡混匀，在37 ℃下水浴1 h，于波长510 nm下测定其吸光度。
1.3 统计分析
采用Excel 2016软件进行数据分析及柱形图的制作，通过SAS9.0软件进行显著性差异。
2 结果与分析
2.1 酿酒葡萄种子基本指标
3个酿酒品种发酵前后种子的基本指标如表1所示，由表可以不同品种种子长宽、百粒重差异显著，其中赤霞珠葡萄的种子显著最大，其百粒重达3.34 g；3个酿酒葡萄种子长宽、百粒重与发酵后其种子长宽、百粒重差异均不显著，葡萄酒发酵对种子大小无明显影响。
2.2 酿酒葡萄种子中发酵前后酚类物质比较
2.2.1 酿酒葡萄种子中发酵前后总酚物质含量比较
酿酒葡萄种子中发酵前后酚类物质含量如图1所示，不同酿酒葡萄种子中酚类物质含量差异显著，其中马瑟兰葡萄种子酚类物质含量显著最高；3个品种发酵后的种子酚类物质含量均显著低于其种子中含量，其中马瑟兰葡萄种子酚类物质含量发酵前后差异最明显，降低了35.98%（P<0.05）；品丽珠葡萄酚类物质含量发酵后降低了32.94%（P<0.05）。
2.2.2 酿酒葡萄种子中发酵前后单宁物质含量比较
酿酒葡萄种子中单宁含量较高，如图2所示为酿酒葡萄发酵前后种子中单宁物质含量，酿酒葡萄赤霞珠和马瑟兰种子中单宁物质含量差异不显著，发酵后两品种间种子单宁物质含量同样差异不显著（P>0.05），发酵过程对3个酿品种种子中单宁提取量为27.65 mg/g-30.08mg/g，占葡萄种子中单宁含量的27.58%以下。
2.2.3 酿酒葡萄种子中发酵前后类黄酮物质含量比较
3个酿酒品种种子中发酵前后类黄酮含量如图3所示，图中3个酿酒品种种子中类黄酮含量差异显著，含量分别10.49 mg/g<13.77 mg/g<15.88 mg/g（P<0.05），且发酵后3个酿酒葡萄种子中类黄酮含量差异显著（P<0.05），含量介于5.77 mg/g-8.50 mg/g，马瑟兰葡萄种子中类黄酮含量显著最高（P<0.05），发酵后种子类黄酮含量显著最低（P<0.05）。
2.2.3 酿酒葡萄种子中发酵前后原花色素物质含量比较
酿酒葡萄发酵前后种子中原花色素物质含量如图4所示，赤霞珠和马瑟兰葡萄种子中原花色素含量较高，分别为5.24 mg/g和4.80 mg/g，但发酵后种子原花色素含量与其果实中种子原花色素含量差异均不显著（P>0.05）。品丽珠葡萄种子中原花色素含量在发酵后显著降低了8.78%（P<0.05）。
2.3 酿酒葡萄种子中发酵前后抗氧化活性比较
2.3.1 酿酒葡萄种子发酵前后DPPH自由基清除率比较
DPPH自由基清除率能够反映种子的抗氧化性能，3个酿酒葡萄种子中发酵前后DPPH自由基清除率如图5所示，3个酿酒品种种子DPPH自由基清除率在78.00%以上，其中赤霞珠与马瑟兰种子DPPH自由基清除率差异不显著（P>0.05），发酵后3个酿酒葡萄品种种子DPPH自由基清除率显著下降（P<0.05），该3个酿酒葡萄发酵后种子DPPH自由基清除率介于66.06%-75.56%。
2.3.2 酿酒葡萄种子中发酵前后羟自由基清除率比较
羟自由基是一种活性氧，具有极强的氧化能力，种子中清除羟自由基能力越强，说明种子抗氧化能力越强。如图6所示为酿酒葡萄发酵前后种子羟自由基清除率，3个酿酒品种种子羟自由基清除率为84.36%-90.50%，发酵后的种子自由基清除率相比其发酵前显著下降，但3个品种种子发酵后之间差异不显著。
2.4 酿酒葡萄种子中发酵前后酚类活性物质相关性分析
对酿酒葡萄发酵前后种子中酚类及抗氧化活性物相关性分析如表2所示，酚类物质和抗氧化物质间呈正相关关系，其中单宁与DPHH清除率呈极显著相关性，类黄酮DPHH清除率呈显著相关性，总酚、单宁和类黄酮之间呈显著相关性。
3 讨论与结论
酿酒葡萄发酵后种子作为葡萄酒厂的主要副产品，常被当作垃圾随意堆放或者倾倒田间地头。发酵后的葡萄种子中仍含有大量多酚物质，研究发现，酿酒品种不同，葡萄种子大小及种子中酚类物质含量差异明显，其中发酵后种子中总酚含量均在92.67mg/g以上，发酵后总酚物质损失比例为35.98以下，发酵后葡萄种子中总酚含量是苹果果皮中总酚含量的10倍，仍具有很高的抗氧化功效。单宁物质是葡萄果实与葡萄酒中重要的酚类物质，单宁表现为一定的涩感，该物质在种子含量较高，研究中赤霞珠和马瑟兰种子中单宁物质含量较高，发酵后种子单宁含量损失量较少，通过70%酒精100w超声波提取20分钟后，单宁含量能达到78.43 mg/g以上。类黄酮物质是一类植物次生代谢产物，具有独特生物活性功能，研究中3个酿酒红色品种发酵后种子中类黄酮含量仍高于酿酒白葡萄霞多丽和维欧尼种子中含量，这与品种特性有关，且发酵后葡萄种子中类黄酮含量高于黄芪茎叶中类黄酮含量。
葡萄种子中原花色素是一种特殊分子结构的生物多酚物质，是国际公认的人体内最有效的天然抗氧化剂，葡萄种子中原花色素含量占葡萄果实总原花色素含量的90%以上，提取葡萄原花色素最好的原料是葡萄种子。本研究中赤霞珠和马瑟兰葡萄种子中原花色素含量较高，且发酵后种子中原花色素含量与葡萄种子中含量差异不显著，是提取发酵后种子中原花色素物质的高产品种。3个酿酒品种发酵后种子DPPH自由基清除率和羟自由基清除率均保持在60.00%以上，表现为较高的抗氧化活性。相关分析表明，单宁与DPHH清除率呈极显著相关性，类黄酮DPHH清除率呈显著相关性，单宁和类黄酮物质具有较强抗氧化能力，可作为发酵后种子提取抗氧物质的主要成分。
酿酒葡萄发酵后种子中酚类物质损失较少，仍具有较高酚类活性物质可以提取浓缩，其中总酚和单宁物质发酵后种子中含量较高，原花色素在发酵后种子中损失最少，单宁和类黄酮物质表现为较强抗氧化能力，生产中可根据产业需求进行发酵后种子酚类活性物质的提取，使葡萄加工业处于可持续发展的良性循环中。