生物防治与综合防控岗位

王忠跃 刘晓慧 黄晓庆 孔繁芳

  甲霜灵属于苯基酰胺类杀菌剂，该类杀菌剂具有低毒、对卵菌类高效、特异性强等特点，其中甲霜灵因兼备预防、保护及治疗作用，在防治卵菌造成的各类病害中使用最为广泛。在投入市场中使用一段时间后，世界多处均出现天然抗性突变菌株，随着甲霜灵使用时间延长和使用剂量的加大，世界范围内葡萄霜霉病菌中抗甲霜灵菌株所占比例日益提高。在我国，各省区葡萄园内均普遍使用甲霜灵、恶霜灵等苯基酰胺类杀菌剂用于防治葡萄霜霉病，病菌对杀菌剂的抗药性问题突出，严重制约葡萄产业的健康持续发展。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  在葡萄霜霉病发病期，采集了我国河北省廊坊市、河北省昌黎县、河南省新乡市、云南省宾川县、山东省蓬莱区、山西省清徐县6个主要葡萄产区的霜霉病样，通过分离、纯化扩繁后总计得到147株葡萄霜霉病菌菌株。

  1.2 接种材料

  葡萄品种：“里扎马特”品种，该品种葡萄对霜霉病表现感病。

  试验时取枝条中上部3-5片健康幼嫩叶片供试，做到摘取前7 d未喷施任何杀菌剂。

  药剂：97%甲霜灵原药：母液配制浓度为1 x105 mg/mL；

  1.3 葡萄霜霉病病菌的纯化与扩繁

  将采集的病样保湿培养2~3天后待叶片长出新鲜霉层。将供试叶片消毒（浓度1% NaClO溶液中浸泡30 s）后，在超净工作台中将清洗干净的叶片用直径为15 mm的打孔器打制成叶盘，打取过程中要注意尽量避开有较多侧脉和主脉的区域，将叶盘背面向上放于1% WA培养基的平板上，一皿10个叶盘为一个重复组。用生物专用直尖头镊子，从原始病叶上经保湿培养7 d后长出的新鲜霉层中挑取单个独立菌斑上的菌丝，用灭菌水配制成浓度为1.0 ×106个/mL的孢子囊悬浮液，用移液枪吸取20 μL孢子囊悬浮液滴在叶盘中央（避开叶脉处），将接种成功的平板进行保湿处理，用小喷壶在培养皿内部均匀喷上一层灭菌水水雾，将平板置于运行程序设置为温度21℃、湿度100%的人工气候培养箱中黑暗处理保持24 h，然后在超净工作台中用灭菌的棉签吸取接种在叶盘表面的菌液，过程中避免对叶盘造成伤口，继续放于人工气候培养箱，恒温培养7~8天后，接种叶盘上新长出的霉层即是葡萄霜霉病菌纯培养物。

  1.4 抗药性测定

  采用传统叶盘法进行。首先将母液稀释到所需药剂浓度为10 μg/mL，将20 mL药液加入到90 mm培养皿，空白对照组以相同体积的灭菌水作为对照；在超净工作台中用灭菌的打孔器将叶片打制成直径为15 mm的圆形叶盘，为做到尽可能不伤及叶片，夹取过程中应用灭菌的镊子小心的夹取叶盘背面边缘叶脉，将叶盘背面向上漂浮放置于配制好的药皿中，若平板中叶盘卷曲应及时予以替换，每药皿中放置10个叶盘，每个药皿为一个重复组，每个浓度设置3个重复。然后配制浓度为1x106个/mL孢子悬浮液，配制方法是用移液枪或干净的球形吸管吸取无菌水，小心的将纯培养得到的孢子从叶盘上冲脱至离心管中，并在显微镜下进行校正，使之达到所需浓度。用移液枪取20 μL菌液滴在叶盘背面中央，设置敏感菌株PV为阴性对照、抗性菌株YQ为阳性对照。经黑暗处理24 h后用灭菌棉签小心吸取叶盘上液滴，然后将培养皿放于同2.2.1的人工气候培养箱中。培养7 d，待对照组全部发病后，调查结果。

  依据Fourier等人研究结果，测定葡萄霜霉病菌对甲霜灵的抗药性情况的鉴定浓度为10 μg/mL（Fourie，2004），即葡萄霜霉病菌在空白对照组中表现为发病、在10 μg/mL试验组中表现为不发病称为敏感菌株；在空白对照组和10 μg/mL试验组中均表现为发病的菌株定义为抗性菌株。

  2. 结果与分析

  采用叶盘漂浮法对我国河北省廊坊市、河北省昌黎县、河南省新乡市、云南省宾川县、山东省蓬莱区、山西省清徐县6个地区，共计147株霜霉病菌进行了甲霜灵抗药性测定，结果如表1所示，霜霉病菌对甲霜灵总体抗性频率为46.9%，其中抗性频率最高的地区为山东省蓬莱区，抗性频率达到了66.7%，而河北省廊坊市抗性频率最低，抗性频率为19.2%，不同葡萄产区间的抗性频率存在显著差异。经过卡方分割检验结果表明（见图1），山东蓬莱地区抗性频率显著高于其他地区；河北昌黎（抗性频率47.5%）、河南新乡（抗性频率50.0%）、云南宾川（抗性频率57.9%）和山西清徐地区（抗性频率45.0%）抗性频率次之，抗性频率在40.0%~60.0%之间；河北廊坊抗性频率最低，抗性频率为19.2%。