熊岳综合试验站
孙凌俊团队
葡萄是世界重要水果之一，在世界范围内种植广泛，目前中国鲜食葡萄的产量与面积已居于世界第一。葡萄产业是辽宁农业的支柱产业之一，截止2020年葡萄栽培面积已达4.48万公顷，产量90.60万吨，分别占全国葡萄的5.5%、6.5%，位居全国第五位和第四位。但辽宁省作为葡萄老产区，随着种植年限的增加，葡萄连作引起的病虫害加重、树体衰弱、再植更新困难等问题，降低了葡萄品质与产量，影响果农经济效益，严重阻碍了葡萄产业的可持续发展。
研究发现，间作已经成为缓解连作障碍的有效措施之一，合理间作能促进植株生长，提高作物产量，降低病害发生率，显著改善土壤微生物种群结构。胡国彬等研究发现，蚕豆与小麦间作使蚕豆的籽粒产量和百粒重分别提高44.29%和12.17%，枯萎病病情指数降低57.14%。郑亚强等研究发现，玉米间作甘蔗使根际微生物功能多样性提高，根际微生物活性增强。目前关于果树间作系统研究多集中在根系、水肥、光照的空间分布与利用等方面，涉及间作对连作果树根际微生态环境影响等方面的研究仍需深入和系统化。本研究基于前期研究结果，选取3种作物与‘贝达’葡萄间作种植，研究不同间作物对连作葡萄根际土壤微生态环境的影响，探讨葡萄间作系统中根际土壤养分、微生物群落结构等变化规律及影响因素，旨在为连作葡萄间作效应研究提供微生态学依据。
1 材料与方法
1.1 试验地点和材料
植物试材为一年生贝达葡萄扦插苗，间作物为大葱（C）、花生（H）、苦荬菜（K），种子购自农发源种子公司；试验地点位于沈阳农业大学葡萄试验园，该园建立于1978年，期间对葡萄更新3次，最近更新后葡萄已生长15年，供试连作土壤基础化学性质为：碱解氮为98.35mg/kg、速效磷109.44mg/kg、速效钾189.8mg/kg、有机质26.53g/kg、pH为6.85。
1.2 试验设计
试验采用槽式栽培方式（80cm×65cm×70cm）；将栽于连作土中的贝达分别与3种间作物定植，间作作物与葡萄的行距分别设5cm、10cm、15cm、20cm、25cm 5个处理。葡萄株距为10cm，两侧为作物种植行，间作物株距为7cm，以不间作的连作葡萄为对照；避雨栽培，常规统一管理。
1.3 试验方法
1.3.1 葡萄生理指标测定
间作种植80d后取葡萄植株测定地上、地下鲜重。
1.3.2 葡萄根际土壤的收集
用抖根法收集葡萄的根际土壤，将土壤混匀后统一过20目筛，一部分风干保存，用于土壤理化性质测定，另一部分保存于-80℃，用于微生物结构测定。
1.3.3 葡萄根际土壤理化性质的测定
碱解氮采用碱解扩散法，速效磷采用钼锑抗比色法，速效钾采用火焰光度计法测定，有机质采用重铬酸钾容量法测定，pH利用pH测量仪测定。
1.3.4 根际微生物结构多样性测定：
土壤微生物DNA提取：采用试剂盒方法（生工Ezup柱式土壤基因组DNA抽提试剂盒）。细菌扩增序列：采用16SrDNA序列中V3区片段进行PCR扩增，引物为F341GC和R518。真菌扩增序列：真菌采用巢式PCR扩增，第一轮引物为ITS1-F和ITS4。第二轮引物为ITS1-F-GC和ITS2-R。
变性梯度凝胶电泳所用变性梯度细菌为40%—60%，真菌为30%—60%，采用8%聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为1×TAE，用微量注射器每孔上样40μL，60℃下180V电压运行6h，电泳完成后用Genefinder染料进行避光染色30min，用凝胶成像系统拍照。
1.4 数据分析
采用化感效应指数（RI）分析生理指标，即（T≥C）RI=1-C/T；（T＜C）RI=T/C-1。T代表处理值，C代表对照值；RI为正值表现促进，RI为负值表现抑制。
采用Quantity One软件分析DGGE的指纹图谱数据，用Shannon指数表示土壤微生物种群多样性；H´= -∑pi×㏑pi，其中pi为某一条带密度占该泳道所有条带密度之和的比值。
采用Excel2010、SPSS20.0软件进行数据分析处理。
2 结果与分析
2.1 间作对连作葡萄生长的影响
间作物对连作葡萄植株鲜重的化感效应指数（图1），得间作大葱处理对连作葡萄长势的影响，除C5处理表现为抑制作用外，其他处理均增加植株总重，促进作用随距离的增加呈现先增强后降低的趋势，其中C20处理促进作用最强；在间作花生处理中，间作5cm处理呈现抑制作用，而10cm处理具有显著的促进作用；而间作苦荬对葡萄重量均表现为抑制，K5处理抑制效果最强。
2.2 间作对连作葡萄根际土壤理化性质的影响
土壤肥力是土壤中各种理化性质的综合反应，根据对不同间作模式下葡萄根际土壤理化性质测定，对土壤理化性质综合水平进行评价，将土壤养分指标进行主成分分析。其中，第一主成分方差贡献率为48.67%，特征值为2.44；第二主成分方差贡献率为21.92%，特征值为1.10。2个主成分累计方差贡献率达到70.58%，基本包含了主要土壤理化信息。
表1为主成分分析得出的各处理土壤养分水平得分及排名。结果可得，各间作处理土壤肥力综合得分整体低于不间作处理；间作苦荬各处理土壤养分综合得分（除K5处理）高于间作大葱处理土壤肥力综合得分；间作花生土壤养分综合得分较低。
2.3 间作对连作葡萄根际微生物结构多样性的影响
通过PCR-DGGE分析不同间作处理对葡萄根际土壤微生物结构多样性的影响。图2为各间作处理对葡萄根际微生物中细菌多样性的化感效应指数，可得出间作降低了连作葡萄根际微生物细菌结构多样性，且间作苦荬处理对细菌多样性（除K25）的化感抑制程度大于间作大葱、花生处理。在间作大葱模式下，微生物细菌多样性为C20＞C25＞C15＞C10＞C5；间作花生处理中，H5处理细菌多样性受到抑制最强，其随间作处理距离的增加多样性呈现低—高—低的趋势；在苦荬间作处理下，K15的多样性受到抑制最强，而K25处理的多样性最高，且随间作处理距离的增加，根际微生物细菌多样性表现为高—低—高的趋势。
不同间作处理对葡萄根际土壤微生物真菌结构多样性的化感效应指数如图3所示，得出间作降低了微生物真菌的多样性，间作苦荬处理真菌多样性受到化感抑制程度低于大葱、花生相应距离的间作处理。在间作大葱模式中，C25微生物中真菌多样性抑制程度最低，C15真菌的抑制程度最高；间作花生处理下，H15处理对根际真菌多样性抑制程度最高，H25处理抑制程度最低，且随间作距离的增加对多样性抑制程度呈现低—高—低趋势；而间作苦荬中，真菌多样性表现为K5＞K25＞K20＞K10＞K15，随间作距离的增加，真菌多样性受到抑制程度表现为先增加后降低的趋势。
图4为各间作模式下根际细菌与真菌结构多样性比值。间作大葱、花生中细菌与真菌比值高于CK处理，苦荬处理的细菌与真菌的比值小于CK处理。间作大葱中，C20处理比值最高；花生处理中H10、H15处理比值最高；间作苦荬处理中K5比值最低。
2.4 间作葡萄根际微生物结构多样性与植株长势、土壤理化性质相关性分析
通过对葡萄根际土壤微生物细菌、真菌多样性比值与各处理葡萄植株总重间的相关性分析发现（见表2），细菌、真菌多样性比值与葡萄长势（即总重）间存在极显著正相关性（p＜0.01）。
通过对不同间作处理下葡萄根际微生物结构多样性与各组分土壤理化性质进行相关性分析发现（如表3所示），细菌的结构多样性与根际土壤pH值间存在显著相关性（p＜0.05），真菌的结构多样性与土壤碱解氮含量间存在显著相关性（p＜0.05）。
3 讨论与结论
3.1 间作对连作葡萄根际土壤理化性质的影响
目前大量研究发现土壤微生态环境在连作中占据着极其重要的位置，土壤养分、土壤微生物及植物之间相互作用，共同维持着土壤微生态环境。试验结果发现，间作大葱、花生、苦荬对根际土壤理化性质各成分的影响无明显规律性，但通过主成分分析发现试验所用间作物降低了土壤理化性质综合水平，降低了根际土壤的肥力水平。可能由于间作物与葡萄之间存在部分养分竞争关系；或由于部分作物间作后存在种间促进作用，提高了连作葡萄对土壤养分的吸收利用，进而降低了根际土壤肥力。如有研究发现，蚕豆玉米间作后，蚕豆和玉米均增加了对土壤养分磷的吸收，并且蚕豆和玉米分别增产26%、43%。
3.2 间作对连作葡萄根际微生物结构多样性的影响
间作被认为是农业生产方式中的精华，不仅是一种高效的种植模式，而且有抗病、增产等优势。间作可优化根际土生物多样性及其群落组成，使微生物总数及细菌、放线菌数量显著提高，进而影响植物长势。试验发现，间作苦荬抑制连作葡萄植株总重，而间作花生、大葱有促进连作葡萄生长的作用，这与前期研究结果一致。同时通过微生物结构多样性发现，细菌与真菌结构多样性比值与各处理对葡萄植株长势（即总重）具有极显著相关性。目前研究普遍认为连作发生的根本原因是根际微生物群落失衡，由细菌型向真菌型转变。间作可使土壤向健康的“细菌型”转变，改善土壤微生态环境。本试验研究发现间作大葱、花生处理细菌与真菌的比值高于对照处理，而间作苦荬处理中其比值小于对照处理，因此认为间作大葱、花生改善葡萄连作障碍的重要方式之一是改善连作葡萄根际土壤微生物细菌与真菌比例。
3.3 间作葡萄根际土壤微生物与土壤理化性质间关系
研究表明根际土壤理化性质与微生物之间存在相互作用；微生物多样性受到土壤理化性质变化影响，而土壤理化性质保持平衡的因素之一是微生物的多样性。李巧玲等研究发现，pH在细菌群落多样性中发挥着重要功能；而碱解N与土壤微生物多样性呈显著相关性。本研究通过对根际微生物结构多样性与土壤理化性质相关性分析得出，根际土中细菌多样性与根际土壤pH值间存在显著相关性，说明其受土壤酸碱性影响较大；而根际土中真菌多样性与土壤碱解氮间存在显著相关性，其变化情况可能与土壤碱解氮的含量存在联系。试验结果证实了前人的研究，表明土壤理化性质中的碱解N与pH值在间作葡萄根际微生物结构多样性中发挥重要作用。