生物防治与综合防控岗位

王忠跃 刘永强 方前东 孔繁芳

  葡萄酸腐病，是造成果穗腐烂的病害一种，在美国与灰霉病、炭疽病等果实成熟期造成果实腐烂的病害一起被称为穗腐病；酸腐病是一种既能影响果实产量又能影响酿酒品质的病害。该病是葡萄果实成熟期病害，导致果实腐烂、汁液流失，造成无病果粒的含糖量降低。鲜食葡萄受害到一定程度，即使是无病果粒，也不能食用，极大地降低产量和质量；酿酒葡萄受害后，汁液外流造成霉菌滋生，干物质含量升高，进而失去酿酒价值。

  酸腐病是一种由醋酸菌、酵母菌及果蝇联合作用造成的综合性病害，其中酵母菌是引起酸腐病的重要因素之一，酵母菌为醋蝇提供蛋白质、维生素等营养物质，同时，醋蝇促进了酵母群落的形成，以酵母菌为食物，并传播酵母菌，二者是互利共生的关系。因此，明确酵母菌种类对有效防控葡萄酸腐病具有重要的意义。

  1.材料与方法

  1.1 样品的采集

  2021年08月19日于湖南省小渡口镇采集夏黑样品。

  1.2 样品的分离培养

  首先将酸腐病果放入YEPD液体培养基，然后在摇床上振荡 1h，在超净工作台内吸取三角瓶内的振荡液并用生理盐水 10 倍梯度稀释到 10-3，在含有100 mg/L青霉素的YEPD培养基上涂布，最后在28 ℃恒温箱内培养3～5 d。然后随机挑取不同形态的菌落在含有100 mg/L青霉素的YEPD培养基平板上划线纯化培养3～5 d，然后随机挑选单菌落在光学显微镜下确认其纯度，并从形态学角度初步判断其是否具有酵母菌的细胞显微特征，对于阳性的菌体首先划线保存于YEPD固体斜面，备用。

  1.3 酵母菌的菌落形态观察

  将分离纯化的菌种在YEPD 平板上划线并在28℃下活化培养1～2 d，将活化的菌株接种于WL培养基，在培养箱中28℃培养5 d后观察记录菌落颜色和形态，同时对每种形态的酵母菌进行显微观察，按菌落不同形态特征对菌株进行初步分类。

  1.4 分子生物学鉴定方法

  将分离纯化的菌种在YEPD 平板上划线并在28 ℃下活化培养1～2 d，挑取3～4个单菌落，然后利用OMEGAFungal DNA Kit200试剂盒按照说明提取DNA，选择引物NL-1/NL-4对病原菌进行扩增，扩增产物经1% 的琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的片段送至生物公司进行测序。

  2.结果分析

  2.1 酵母菌菌落形态特征

  28℃下，置于YEPD培养基上培养3～5 d， 从图1可知，6株供试菌株呈现出4种不同的菌落形态，其中A3、A4和A6菌落形态一致，可以推测3株菌可能属于同一个酵母菌种群；其余3株菌呈现不同的菌落形态，区别明显。

  2.2分 子生物学鉴定结果

  将测得的序列在NCBI网站进行Blast同源搜索，与GeneBank中的相关序列进行同源性比对分析，目前分离到的酵母菌要有4种，分别为Saccharomyces cerevisiae、Pichia fermentans、Candida quercitrusa、Hanseniaspora uvarum。