苗木生产岗位
卢浩成 王军
酚类物质对葡萄酒的品质至关重要，葡萄酒中的酚类物质主要有花色苷，贡献葡萄酒的颜色，是葡萄酒中最主要的色素；黄烷醇，贡献葡萄酒的涩感和收敛性，还能与花色苷结合生成聚合花色苷，有利于颜色的稳定；黄酮醇，是植物的光保护剂，保护葡萄免受紫外辐射，同时也具有辅色效应，使花色苷颜色更稳定。
葡萄酒香气物质组分对构成葡萄酒风味和感官品质具有重要影响，葡萄酒中的香气物质种类很多，含量从ng/L级到mg/L级均有，根据葡萄酒香气物质的结构和官能团，可以分为酯类、高级醇类、酸类、醛酮类、苯类、萜烯类及降异戊二烯类。不同类别的香气物质对葡萄酒的感官贡献不同，例如萜烯和降异戊二烯类物质贡献花香和果香，酯类贡献水果风味，酸类贡献腐败、酸臭等不良风味。香气物质的含量和组成受多种因素影响，如品种、环境条件、栽培措施等。
叶面喷肥指的是直接将营养元素施用于作物叶片表面，通过叶片的吸收而发挥功能，具有技术简单、用量少、见效快、利用率高等优点，在葡萄生产中逐渐被广泛应用。前人研究表明，叶面喷肥能提高葡萄果实的穗重、可溶性固形物、糖酸比、产量等，此外，不同叶面肥对葡萄品质影响也不一致，与叶面肥的浓度、种类及组成有关，还有些叶面调节剂能提高果实花色苷含量，从而提高酿成葡萄酒的颜色指标。因此，但关于叶面肥对葡萄酒酚类物质的影响尚未见报道。
新疆中信国安葡萄酒业公司地处昌吉州玛纳斯县，每年加工酿酒葡萄可达2万t，储酒达8万t，已经带动了1.5万户农民增收致富。长期栽培酿酒葡萄中，公司形成了合理、科学的土肥水制度，在此背景下，是否需要叶面喷肥来提高葡萄果实品质，进而提高酿成葡萄酒的质量还没有理论依据，因此研究叶面喷肥对葡萄酒品质的影响至关重要。本试验在赤霞珠葡萄幼果膨大期于叶面喷施津平1号水溶肥，通过与不喷肥的对照组进行对照，探究了叶面喷肥对葡萄酒酚类物质的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料为2013年定植的赤霞珠葡萄。实验地位于新疆中信国安葡萄酒业有限公司自建基地（44°14′N，86°15′E），植株株行距为1.0×3.0 m。采用VSP叶幕整形，主干高度约65.0 cm，自根苗。
津平1号水溶肥，购置于当地农业市场，稀释400倍后使用。6月26日（花后30天）起，处理组（记为SF）使用喷壶喷施于赤霞珠葡萄叶表面，其后每2周喷施一次，共喷施6次；对照组（记为CK）不喷肥。
1.2 葡萄果实理化指标的测定
100粒浆果挤压得到果汁，用手持糖度计（PAL-1, Atago, Japan）测定果汁可溶性固形物含量，用pH计测定果汁 pH值；用NaOH溶液滴定果汁的稀释样品，以酒石酸（g/L）计果实的可滴定酸。
1.3 小规模发酵
当葡萄果实的总可溶性固体（TSS）含量达到24-25 °Brix时进行采收并进行小规模发酵试验。酿酒过程如下：对照组（CK）和叶面喷肥组（SF）各采集40 kg葡萄果实，除梗破碎，并转移到20L不锈钢容器中（每个处理两个重复），加入0.8 g SO2，然后在葡萄汁中加入0.4 g果胶酶（Optivin®，澳大利亚）和4.0 g Lalvin D254菌株（Lallemand Inc，法国）。酒精发酵在24℃左右的温度下进行，每天压帽2次，当残糖达到4 g/L以下时，进行皮渣分离，并加入0.1 g乳酸菌（Lalvin 31，Lallemand Inc，法国）。苹乳发酵结束后，向葡萄酒中加入0.6克SO2，葡萄酒样品装瓶后在10-15℃下储存一个月后再进行分析。
1.4 酚类物质的测定
葡萄酒酚类物质的检测采用美国Agilent 1200系列高效液相色谱仪，配备6410三重串联四级杆质谱仪（QqQ）。所用色谱柱为Poroshell 120 EC-C18色谱柱。样品测定前经0.22 μm水系滤膜过滤，进样量5 μL。洗脱采用的流动相为：0.1%的甲酸水溶液为A相，含0.1%甲酸的50/50的甲醇乙腈溶液为B相。流动相流速为0.4 mL/min。柱温箱度控制在55 °C。质谱采用AJESI离子源，喷雾电压为4 kV，离子源温度为150 °C，干燥气温度为350 °C，流量为12 L/h ，雾化器压力为35 psi。检测器为多反应监测模式（MRM）。
花色苷的检测采取正离子模式，洗脱程序为10% ~100%的B相持续15 min，后运行程序5 min。非花色苷酚采取负离子模式，梯度洗脱程序为0~28 min，10%~46% B；28~29 min，46%~10% B，后运行程序5 min。
花色苷及非花色苷酚的定性依据为农业农村部葡萄酒加工重点实验室所建立的葡萄与葡萄酒酚类物质（高效液相色谱-质谱联用）指纹谱库。定量采用外标法，花色苷定量以二甲翠花翠素-3-O-葡萄糖苷为外标物，黄酮醇以槲皮素为外标物，黄烷醇以儿茶素、表棓和没食子酸酯为外标物，单位表示为mg/L。
1.5 香气物质的测定
葡萄酒香气物质检测利用农业农村部葡萄酒加工重点实验室已优化的顶空固相微萃取方法对葡萄汁和葡萄酒香气物质进行萃取，并利用气质联用的方法分析样品中的香气物质。载气为高纯氦气，流速为1 mL/min。升温程序如下：50°C保持1 min，然后以3°C/min升温至220°C，最后保持5 min。其余条件如下：进样口温度为250°C，葡萄酒的检测采取5:1分流模式，葡萄汁的检测采取不分流模式，电离方式为电子电离（electron ionization, EI）源，电离能为70 ev，离子源温度为230 °C，质谱接口温度为280 °C，质量扫描范围为30~350 u。
挥发性香气物质的定性根据NIST标准谱库中的保留指数和质谱信息进行分析。香气物质的定量根据对应的标准曲线进行，单位表示为μg/L。
1.6 数据处理
采用SPSS 23.0进行统计分析，绘图采用Graphpad Prism 8.0软件。
2 结果与分析
2.1 叶面喷肥对赤霞珠葡萄理化指标的影响
赤霞珠葡萄果实可溶性固形物含量随着果实发育逐渐升高，8月25日时CK组与SF组可溶性固形物含量差距最大，随后差距逐渐缩小，至9月9日采收时可溶性固形物含量没有差异，均为23.4°Brix。这说明叶面喷肥可以促进葡萄果实可溶性固形物的积累，但在停止喷肥后，这种效应逐渐减弱，至停止喷肥30天后差异消失。
果实可滴定酸含量随着果实发育逐渐下降，9月6日以前，CK组的可滴定酸含量高于SF组，9月6日两组可滴定酸含量没有差异，9月9日SF组可滴定酸含量更高，采收时两组可滴定酸含量分别为CK组7.6 g/L，SF组9.1 g/L。pH值的变化趋势总体上与可滴定酸变化趋势相反，这与常识相符，因为酸高的样品pH低。
2.2 叶面喷肥对赤霞珠葡萄酒花色苷类物质的影响
在对照组与喷肥组赤霞珠葡萄酒中共检测出15种单体花色苷（数据未展示）。根据花色苷的结构将15种单体花色苷分为5类，分子量由小到大分别为花青素类花色苷，花翠素类花色苷，甲基花青素类花色苷，甲基花翠素类花色苷，以及二甲花翠素类花色苷（表1），其中二甲花翠素类花色苷是含量最高的花色苷种类，而花青素类花色苷含量最少。与CK相比，SF葡萄酒的5类花色苷均较低，分别低12.7%，26.6%，23.9%，11.0%及18.7%，这也导致了SF葡萄酒的单体花色苷总量比CK葡萄酒低23.2%。根据花色苷的修饰程度，将花色苷分为甲基化花色苷以及酰化花色苷，SF组葡萄酒甲基化修饰和酰化修饰的花色苷也分别比CK组葡萄酒低23.2%和16.6%，但计算其占总单体花色苷的比例发现，SF组葡萄酒的甲基化花色苷占比（98.2%）与CK组（98.1%）接近，而SF组葡萄酒的酰化花色苷占比（51.7%）明显高于CK组（47.6%），说明叶面喷肥处理不仅影响了单体花色苷的含量，也在一定程度上改变了花色苷的组成。在葡萄酒陈酿过程中，花色苷除了以单体形式存在，还能与葡萄酒中其他物质如黄烷醇、丙酮酸、乙醛等生成聚合花色苷。与CK组葡萄酒相比，SF组葡萄酒的聚合花色苷含量较低，为16.14 mg/L，与单体花色苷的趋势一致。
花色苷是葡萄酒中重要的呈色物质，总体来说，与CK组葡萄酒相比，SF组葡萄酒的5类单体花色苷及2种修饰类型的花色苷含量均较低，说明叶面喷肥对葡萄酒的色泽具有一定负面影响。
2.3 叶面喷肥对赤霞珠葡萄酒黄烷醇类物质的影响
叶面喷肥下葡萄酒黄烷醇类物质的含量如表2所示，共检测出7种黄烷醇单体，分别为儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、以及原花青素B1、原花青素B2、原花青素C1，其中含量较高的有原花青素B1、原花青素B2、C、EC及EGC。与CK组葡萄酒相比，SF组葡萄酒的单体黄烷醇普遍较低，特别是原花青素类黄烷醇，其含量分别是对照组的62.7%和55.1%，其他单体黄烷醇类在SF组葡萄酒中也有小幅度下降，但下降幅度较低。
黄烷醇是葡萄酒中具有辅色效应的重要酚类物质，同时贡献葡萄酒的涩感和收敛性。总体来说，与CK组葡萄酒相比，SF组葡萄酒的各单体黄烷醇含量均较低，但不同黄烷醇类物质下降幅度不同，说明叶面喷肥对不同黄烷醇代谢路径的影响存在差异，并且说明叶面喷肥对葡萄酒颜色的稳定性具有一定负面影响。
2.4 叶面喷肥对赤霞珠葡萄酒黄酮醇类物质的影响
叶面喷肥下葡萄酒黄酮醇类物质的含量如表3所示，共检测出12种黄烷醇单体，分别为山奈酚类、槲皮素类、杨梅酮类及丁香亭4类，糖苷配基有半乳糖苷、葡萄糖苷、鼠李糖苷和葡萄糖醛苷4类。其中杨梅酮-葡萄糖苷的含量最高，分别为6.45 mg/L及6.26 mg/L，槲皮素类黄酮醇含量最高，在CK组和SF组中分别占比56.1%和53.0%，山奈酚类和丁香亭类黄酮醇含量较少，不足1.5 mg/L。与CK组葡萄酒相比，叶面喷肥处理普遍降低了葡萄酒黄酮醇含量，但降低幅度较小，SF组葡萄酒的总黄酮醇含量下降10.7%。山柰酚-葡萄糖苷的降低幅度最大，达到31.2%，SF组中的杨梅酮与CK组没有差异。值得注意的是，丁香亭-葡萄糖苷和二氢槲皮素的变化趋势与其他黄酮醇不一致，SF处理分别提高10.9%和15.4%，说明丁香亭-葡萄糖苷和二氢槲皮素的代谢机制可能与其他黄酮醇存在差异，值得进行进一步探究。
总体来说，SF处理葡萄酒的大多数黄酮醇含量均低于CK组葡萄酒，仅有个别单体黄酮醇含量没有差异或在SF组中更高，说明叶面喷肥对葡萄酒中黄酮醇类物质具有一些负面影响。
2.5 叶面喷肥对赤霞珠葡萄酒香气物质的影响
在赤霞珠葡萄酒中共检测出51种香气物质（表4），根据结构分为6大类，分别为酯类（17种）、苯类（6种）、醛酮类（1种）、高级醇（17种）、酸类（6种），以及降异戊二烯类（1种）。在所有香气大类中，高级醇和酯类的含量最高，CK组与SF组含量均在200000 μg/L以上，其次是酸类和苯类，降异戊二烯类含量最低，仅检测出1种大马士酮，在CK组与SF组中的含量分别为4.11 μg/L和3.47 μg/L，醛酮类也仅检测出1种物质，为3-羟基-2-丁酮，在SF组中的含量是CK中的2.17倍。香气总浓度方面，SF组是CK组的1.19倍，说明叶面喷肥也可以提高赤霞珠葡萄酒中的香气浓郁度。
CK组葡萄酒的大多数酯类化合物高于SF组葡萄酒，有少数物质例外，如丁二酸二乙酯，2-羟基丙酸乙酯等。CK组酯类总浓度远低于SF组，这也是由于上述2物质在SF组中含量远高于CK组所致。苯类化合物的6个组分中，半数苯类化合物在SF组中有更高的含量，包括苯甲醇、苯甲酸乙酯及苯酚，其中SF组葡萄酒苯甲醇含量远高于CK组，是其含量的2.16倍。高级醇中，除了7种物质在SF组中的含量更高以外，其余9种物质均在CK组中含量更高，因此总的高级醇含量也是CK组中更高。酸类化合物中，仅有辛酸在SF组中更低，其余物质均是CK组中更高。
综上所述，不同香气物质受叶面喷肥处理的影响不同，其中酯类、醛酮类和酸类香气物质在SF组葡萄酒中的含量更高，而苯类、高级醇和降异戊二烯类物质则在CK组中更高，这说明不同的香气代谢物通路对叶面喷肥的响应存在差异，值得进行深入的研究。
2.6 叶面喷肥对赤霞珠葡萄酒香气活性值的影响
不同香气物质在葡萄酒中的含量有很大差距，为了探究其对葡萄酒香气感官的贡献，计算了不同香气物质的香气活性值（OAV），OAV由物质的浓度（mg/L）除以阈值得到，表5展示了OAV >1的物质，代表其对葡萄酒的香气贡献度较高，一共有9种物质，包括高级醇（4种），酯类（3种），酸类和降异戊二烯类各1种，在葡萄酒中贡献了花香、果香、焦糖香，以及植物味和杂醇味等风味，但贡献不良风味的3种物质OAV均较低，说明处理和对照所酿葡萄酒的香气均较好。OAV最高的物质是辛酸乙酯，在葡萄酒香气中贡献花香，在CK组与SF组中均高于250，且CK组高于SF组39.3%，在OAV >10的4种物质中，CK组葡萄酒的OAV值均高于SF组，说明CK组葡萄酒的香气整体优于SF组。
3 结论
本研究探究了叶面喷肥对赤霞珠葡萄酒酚类物质的影响，结果显示：与对照组不喷肥葡萄酒相比，叶面喷肥葡萄酒中各项酚类物质含量均有不同程度的降低，其中单体花色苷总量降低23.2%，聚合花色苷总量降低35.7%，总黄烷醇含量降低26.7%，总黄酮醇含量降低10.7%。在所酿葡萄酒中鉴定出6大类共51种香气物质，其中酯类、醛酮类和酸类香气物质在SF组葡萄酒中的含量更高，而苯类、高级醇和降异戊二烯类物质则在CK组中更高。香气活性值方面，9种香气物质对葡萄酒的香气贡献度较高，且在OAV>10的4种香气物质中，CK组的OAV均高于SF组。本研究表明，在新疆昌吉玛纳斯酿酒葡萄酒产区以及当地的土肥水管理情况下，叶面喷肥会降低葡萄酒中酚类物质含量，叶面喷肥处理提高了香气物质浓度但香气物质对感官贡献较低。