华东华南区栽培岗位

农慧兰 董阳 刘静 余欣 黄丽媛 郑焕 陶建敏

 

  葡萄在我国果树生产中占有重要地位，与苹果、梨、香蕉、柑橘和桃并称为我国六大水果(王海波等, 2010, 中国果树, 06, 69-71)。作为鲜食葡萄第一生产大国，我国有34个省(市、自治区)均有葡萄栽培(田淑芬, 2009, 中外葡萄与葡萄酒, 01, 64-66)。‘阳光玫瑰’葡萄(Vitis labruscana Bailey×Vitis vinifera L. ‘Shine Muscat’)是欧美杂交种，果穗整齐美观，果皮薄，果实脆甜，具有特殊的玫瑰香味，口感好，被认为是极具发展潜力的鲜食葡萄品种(王博等, 2016; 韩佳宇等, 2021, 中国南方果树, 50 (04), 144-146+152)。‘阳光玫瑰’葡萄容易落花落果，且对赤霉素处理敏感。

 

  【研究意义】果实形状是园艺植物的重要特征，可以用来区分特定物种的品种。同时，果实形状也是果品市场品质评价、分类和定级的重要考核指标(谢兆森等, 2011; 乔军等, 2011)。随着经济的发展和人民生活水平的提高，消费者更青睐于新、奇、特、优的高品质产品；而生产者和研究者在保证果品产量的同时，更注重其品质的提高，以增强市场竞争力，提高经济效益。可见，果实形状在很大程度上影响了果品的经济价值。目前，在生产上大多采用植物生长调节剂来调控果实形状。因此，研究植物生长调节剂对葡萄果实形状的影响，具有一定的现实意义，可为利用植物生长调节剂调控葡萄果实形状提供理论依据和技术指导。

 

  【前人研究进展】不同的植物生长调节剂对同种果树的果实形状产生不同影响(丁长奎等, 1988, 园艺学报, 03, 148-154)。同一大类的植物生长调节剂对同种果树的效应也不同(姜卫兵, 1992, 果树科学, 02, 117-122)。用GA3处理‘巨峰’葡萄，可促进果实变长，而GA4+7处理则可以使果实变圆，可能与GA4/GA7对细胞分裂具有抑制作用，促进细胞的膨大的作用有关(陶建敏等, 2005)。不少研究表明，GA3处理对增大果实形状指数有显著作用(杨玉艳等, 2012; 赵荣华等, 2014)。GA3促进果实的细胞分裂，特别是顶端分生组织的细胞分裂，并使果肉细胞伸长、增大(陶建敏等, 2003, 中外葡萄与葡萄酒, 06, 33-35)。GA3使用后能增加生长素的含量，GA3、生长素、细胞分裂素均有调运、吸引营养物质的作用，使果实成为强“库”，在营养竞争中处于有利地位(陶建敏等, 2003, 中外葡萄与葡萄酒, 06, 33-35)。但使用GA3处理葡萄花穗后容易造成葡萄穗轴、果梗硬化而产生落粒(杨玉艳等, 2012; 周咏梅等, 2015, 赵佳等, 2017)，添加CPPU和TDZ可以显著提高坐果率，提高果实品质(李玉利等, 2015, 中国南方果树, 44 (04), 88-90; 江平等, 2017; 黄海娜等, 2019; 程大伟等, 2021)。使用TDZ处理葡萄，会降低果实的果形指数，降低果实硬度(谢周, 2009, 江苏农业科学, 03, 188-190; 奚晓军等, 2014, 王莎等, 2019)。此外，在不同时期使用植物生长调节剂，对果实的形状发育影响也存在差异。在开花期使用20 ppm的GA处理‘汤普森无核’葡萄，果实变长；处理较迟则使果实增大(Christodoulou et al, 1966)。

 

  【本文切入点】本课题组前期积累了丰富的外源激素处理对葡萄果实生长发育影响的生理数据，发现在生产实践上花后用25 mg/L GA3处理‘阳光玫瑰’葡萄果穗较为适宜，果实品质高，风味好；而适当浓度的TDZ可以提高葡萄坐果率和促进果实膨大(李婉雪, 2016; 冯娇, 2018; 魏玲玲, 2019; 郑直, 2021)。本研究在保证葡萄坐果率和果实品质的情况下，探究外源GA3和TDZ处理对‘阳光玫瑰’葡萄果实形状、内源激素水平和相关基因表达水平的影响。

 

  【拟解决问题】在葡萄生产中，GA3处理已经是一种常规的生产栽培技术，被广泛应用于单性结实、提高坐果率、提高果实品质等方面(Maaike et al, 2009; 陈晓东, 2007)，但对果实形状方面研究较少。探究GA3和TDZ处理对‘阳光玫瑰’葡萄果实形状的影响及其内在机理，为葡萄的果形育种提供理论和技术支持。

 

  1 结果与分析

 

  1.1 不同外源激素处理显著改变‘阳光玫瑰’葡萄果实形状

 

  如图1所示，与清水对照相比，GA3处理24 h后，‘阳光玫瑰’葡萄果实纵径开始显著增大；而GA3+TDZ组合处理7 d后，果实纵径开始显著增大，但始终小于GA3处理。处理4 d后，横径开始发生显著变化，GA3+TDZ组合处理的‘阳光玫瑰’葡萄果实横径最大，GA3处理次之，对照最小。在GA3处理24 h后，‘阳光玫瑰’葡萄果形指数开始显著大于清水对照；GA3+TDZ组合处理4 d后，果形指数开始显著小于清水对照。说明GA3处理可以使葡萄果实伸长，GA3+TDZ组合处理可以使葡萄果实膨大变圆，形成明显的底部“凹槽”。

 

 

 

  1.2 不同外源激素处理对‘阳光玫瑰’葡萄果实中内源激素水平的影响

 

  通过ESI-HPLC-MS/MS方法测定了不同外源激素处理和清水对照样品中内源赤霉素(GA3)、生长素(IAA)和IAA-天冬氨酸(IAA-ASP)的含量。结果表明，GA3处理之后48 h和4 d后，‘阳光玫瑰’葡萄果实中的赤霉素和IAA-ASP含量显著高于对照，说明外源GA3处理显著提高了葡萄果实中赤霉素和IAA-ASP的含量；GA3+TDZ组合处理之后48 h和4 d时，葡萄果实中的赤霉素和IAA-ASP含量显著高于对照，但显著低于GA3处理，说明GA3+TDZ处理可以显著抑制葡萄果实中赤霉素和IAA-ASP的含量(图2A, C)。GA3处理48 h和4d后，葡萄果实中生长素含量开始显著高于对照，GA3+TDZ组合处理4 d后也开始显著高于对照，但与GA3处理相比，GA3+TDZ组合处理48 h 后，葡萄果实中生长素含量显著下调，在处理后4 d生长素含量下降，但不显著(图2B)。说明GA3处理会使葡萄果实中内源赤霉素、生长素和IAA-ASP含量升高；与GA3处理相比，GA3+TDZ处理会使葡萄果实中内源赤霉素、IAA-ASP和生长素含量下降。

 

 

  1.3 不同外源激素处理对‘阳光玫瑰’葡萄果实中内源激素生物合成和信号转导相关基因表达模式变化影响

 

  通过qRT-PCR发现，赤霉素合成关键基因VvGA20ox-1呈先升高后下降的趋势，在处理后12 h时表达量最高；外源GA3处理后，VvGA20ox-1基因表达量显著下降，表明GA3处理后葡萄果实内GA合成呈负反馈调节；相反，GA3+TDZ组合处理后，果实内VvGA20ox-1基因的表达量显著上升 (图3A)。VvDELLA是赤霉素响应抑制转录因子，两种处理的果实中VvDELLA基因表达量都显著升高，GA3处理后7 d效果最显著，而GA3+TDZ组合处理后12 h效果最显著，说明外源GA3和TDZ的处理显著影响了果实中赤霉素信号转导(图3B)。VvYUCCA6是葡萄葡萄中生长素合成关键基因，GA3处理显著提高了VvYUCCA6基因的表达量，特别是在处理24 h后显著提高了约9倍；相反，GA3+TDZ组合处理后VvYUCCA6基因的表达量显著下降（图 3C）。GH3与生长素稳态相关，GA3处理后显著提高了VvGH3基因的表达量，特别是在处理后7 d显著提高了约6倍；而GA3+TDZ组合处理后VvGH3基因表达量呈先降低再升高后降低的趋势(图3D)。SAUR基因参与生长素信号的快速响应，与对照相比，GA3处理后，VvSAUR21-1基因的表达量显著升高；在GA3+TDZ组合处理后6 h-48 h，VvSAUR21-1基因的表达量显著升高，但与GA3处理相比，显著下调表达；GA3+TDZ组合处理后4 d-14 d，VvSAUR21-1基因的表达量显著下降(图3E)。GA3处理后，与对照相比，VvSAUR21-2基因的表达量显著升高，处理后7 d时最为显著；GA3+TDZ组合处理后，VvSAUR21-2基因的表达量显著升高，但与GA3处理相比，显著下调表达，在处理后7d时最为显著（图3F）。

 

 

  2 讨论

 

  果实形状多为数量性状，由多基因控制，采用传统的育种方式如杂交、回交、自交等进行果实形状的改良，需要相当大的种植规模以及相当长的筛选时间(柴丹丹, 2008)。目前，葡萄果实形状的研究多集中于生理方面，尤其是植物生长调节剂的使用上。外源GA3处理在葡萄无核化、果实膨大等方面应用广泛，但在果实形状方面研究较少。因此，本研究以‘阳光玫瑰’葡萄为材料，解析了不同外源激素处理后葡萄果实形状、内源激素含量和相关基因表达变化情况。结果发现，两种处理都显著改变了葡萄果实形状，GA3处理后的葡萄果实细长，果形指数升高；GA3+TDZ处理后的果实呈扁圆形，且带“凹槽”，果形指数下降。

 

  外源GA3处理后，葡萄果实中赤霉素和生长素及其他激素在代谢和信号转导途径上发生互作(Chai et al., 2014)，细胞分裂素通过调节生长素和赤霉素途径影响果实发育(柴丽娟, 2017)。因此，我们通过ESI-HPLC-MS/MS方法测定了葡萄果实中的赤霉素、生长素和IAA-ASP含量。GA3是植物体内的具有生物活性的赤霉素之一(Yamaguchi, 2008)，IAA是植物体内最主要的生长素(Simon and Petrasek, 2011)，IAA-ASP是IAA的主要储存形式(Hayashi et al., 2021)。与前人研究结果一致，与对照相比，GA3处理均显著提高了果实中赤霉素、生长素和IAA-ASP的水平(周琪, 2021)；与GA3处理相比，GA3+TDZ处理则使果实中赤霉素、生长素和IAA-ASP含量下降；表明果实形状的改变与内源激素的变化相关。

 

  通过qRT-PCR试验检测了两种处理的葡萄果实中赤霉素、生长素合成和信号转导的相关基因应答模式。GA20ox作为赤霉素生物合成阶段的限速酶, 在赤霉素生物合成过程中起关键作用。GA3处理后，VvGA20ox-1基因表达量显著下调，表明果实中赤霉素合成呈负反馈调节(柴丽娟, 2017)；与GA3处理相比，VvGA20ox-1基因表达量显著上升，表明TDZ的使用影响了果实中赤霉素合成。DELLA蛋白是GA信号传导途径的核心作用元件，对植物的生长发育起负反馈调节作用(Li et al., 2018)。GA3处理后，VvDELLA基因的表达量显著上升；与GA3处理相比，GA3+TDZ处理果实中VvDELLA基因表达量更高，在处理7 d后回降，表明GA3和TDZ处理均显著影响果实内赤霉素的信号转导。YUCCA在IAA生物合成吲哚丙酮酸途径中起重要作用(Brumos et al., 2014)。GH3(Gretchen Hagen3)和SAUR(Small auxin up RNA)是原初生长素反应基因，参与生长素调节转录过程(胡晓等, 2017)。与对照相比，GA3处理果实中生长素合成相关基因VvYUCCA6和信号转导基因VvGH3、VvSAUR21-1、VvSAUR21-2的表达量显著升高；与GA3处理相比，GA3+TDZ处理果实中这些基因的表达量显著下降，特别是VvGH3基因的表达量显著低于对照。

 

  由此推测，外源GA3和TDZ处理通过调节果实中赤霉素和生长素的合成和信号转导途径来影响果实形状。

 

  3 材料与方法

 

  3.1 试验材料

 

  以3年生‘阳光玫瑰’为试验材料，采用平棚架避雨栽培，株行距3.0 m×6.0 m，“H”树型。果园土肥水及病虫害防治同常规管理。

 

  3.2 试验设计

 

  试验于2020年5-6月在江苏省南京市江宁区上峰镇南京农业大学汤山葡萄试验基地进行。随机选取树势相近的树体上长势基本一致的结果枝，每枝仅留1个花穗作为试验对象。以花序穗肩的第一个小穗上50%的小花开放为盛花期，在盛花后3 d进行处理，处理前集中疏花疏果，每穗大小保持一致。试验设计3个处理，GA3处理：用25 mg/L GA3处理花穗；GA3 + TDZ处理：用25 mg/L GA3 + 3 mg/L TDZ处理花穗；对照(CK)：清水处理。每个处理15穗，重复3次。

 

  采集处理后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、4 d、7 d和14 d的葡萄果实，采集的样品一部分用于测量果实的纵横径，另一部分立即用液氮速冻，并保存于-80℃冰箱中。

 

  3.3 果实纵横径的测量及果形指数的计算

每

  个采样时期各取20个果粒，用体视显微镜观察，并测量其纵横径，计算果形指数。

 

  3.4 内源激素的测定

 

  采用高效液相色谱电喷雾串联质谱法(ESI-HPLC-MS/MS)测定处理后48 h和4 d的‘阳光玫瑰’葡萄果实中的内源激素，采集激素样品前进行清水冲洗。以1290高效液相色谱仪(安捷伦)串联Qtrap6500质谱仪(AB SCIEX)，GCB、C18 QuECherS填料(上海安谱)，色谱级甲醇、乙腈(德国默克)，GA3、IAA、IAA-ASP标准品(Sigma)。

 

  3.4.1 样品提取

 

  (1)将样品于液氮中研磨至粉碎，准确称量1 g新鲜植物样品于玻璃试管中，加入10倍体积乙腈溶液，并加入4 μl内标母液；

 

  (2)4 ℃提取过夜，12000 g离心5 min，取上清；

 

  (3)沉淀再次加入5倍体积乙腈溶液，提取两次，合并所得上清液；

 

  (4)加入35 mg C18填料，剧烈震荡30 s，10000 g离心5 min，取上清；

 

  (5)氮气吹干，以400 μl甲醇复溶，过0.22 μm有机相滤膜，放入-20 ℃冰箱待上机检测。

 

  3.4.2 色谱及质谱条件

 

  色谱柱：poroshell 120 SB-C18反相色谱柱(2.1 × 150, 2.7 um)；柱温：30 ℃；流动相：A:B= (甲醇/0.1%甲酸):(水/0.1%甲酸)；洗脱梯度：

 

 

 

  进样体积：2 μl。

 

  电离方式：ESI正负离子模式分别监测；扫描类型：MRM；气帘气：15 psi；喷雾电压：+4500 v，-4000 V；雾化气压力：65 psi；辅助气压力：70 psi；雾化温度：400 ℃。

 

  3.5 RNA提取、反转录和qRT-PCR

 

  RNA提取采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒(TIANGEN)。定量反转录采用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa)。qRT-PCR采用TB Green Fast qPCR Mix 荧光定量qPCR试剂盒(TaKaRa)，引物设计如表1所示，反应体系为TB Green Fast qPCR Mix 1μL，正向引物、反向引物各0.5 μL，用ddH2O稀释后的模板cDNA 1 μL，加ddH2O补至20 μL。qRT-PCR在QuantStudio5荧光定量PCR仪(ABI)上进行，反应程序为：95 ℃，4 min；95 ℃，20 s；60 ℃，20 s；72 ℃，40 s；40个循环。由ABI 7300 system软件完成试验程序的操作和数据的导出，相对表达量计算用2-∆∆Ct方法进行分析。

 

 

  3.6 数据处理

 

  用Excel 2010和SPSS 17.0进行数据处理和显著性分析，Adobe Illustrator 2021作图。