病毒病防控岗位

任芳 董雅凤 张尊平 范旭东 胡国君

  葡萄是感染病毒种类最多的果树，全世界已报道侵染葡萄的病毒达80余种，我国已报道近20种。特别是近几年随着高通量测序及分子生物学技术的发展，检测发现的葡萄病毒种类也在快速增加。新病毒的发现、鉴定和检测，有助于更好地了解和掌握葡萄病毒病发生危害情况以及制定相应的病毒病防控策略。病毒寄生在寄主植物体内，看不见摸不着，甚至很多葡萄病毒在植株外观上还可能不表现明显症状，给病毒检测带来难度，因此高效灵敏的检测手段对病毒的发现和鉴定至关重要。目前，对于葡萄病毒特别是一些新病毒的发现常用高通量测序结合常规PCR等方法。本实验通过高通量测序和RT-PCR检测在我国首次发现并鉴定了一种葡萄新病毒：葡萄碗豆耳突花叶病毒-1（Grapevine enamovirus-1，GEV-1）。该病毒是2017年在巴西首次发现的一种葡萄新病毒，隶属于黄症病毒科（Luteoviridae）碗豆耳突花叶病毒属（Enamovirus）。

  为了解掌握该病毒的最新发生蔓延动态，明确该病毒在我国是否发生，我们开展了GEV-1的检测和鉴定研究，并通过引物筛选建立了该病毒的RT-PCR检测方法，为进一步掌握该病毒发生危害情况，深入了解其基因组结构和分子遗传变异情况等奠定基础。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  本试验用于高通量测序分析的葡萄样品为中国农科院果树所试材保存圃中保存的一棵‘蛇龙珠’（Cabernet Gernischt）葡萄植株。用于大量检测的田间样品为试材保存圃中来自我国约20个省市的葡萄植株。

  1.2 高通量测序及基因组全长扩增

  秋季采集葡萄植株老叶、老叶柄和枝条等组织部位混合取样，采用去除rRNA非链特异性方法建库，利用Illumina HiSeq X-ten平台进行高通量（HTS）测序，测序结果采用CLC Genomics Workbench 9.5 (QIAGEN)分析。所得序列采用BLSAT比对，确定与已报道葡萄病毒的序列相似性。根据高通量测序获得的contig序列，利用软件Primer premier 5.0及Oligo 6.0设计3对引物GEV-1F/1R、GEV-2F/2R和GEV-3F/3R用于扩增病毒基因组全长（表1）。5’和3’末端序列采用RACE试剂盒SMARTer RACE 5’/3’ Kit进行。采用DNAStar 7.0和MEGA 4.0.2软件进行序列比对和进化树构建。

  1.3 RT-PCR检测方法建立

  刮取葡萄休眠枝条韧皮部约50 mg，采用改良吸附柱法提取总RNA，–80℃保存。采用M-MLV反转录酶合成cDNA，反转录体系25.0L：5.0L总RNA与1.0 L随机引物和9.0L水混合，95℃变性5min后立即冰浴2min；加入5.0L 5×MLV-RT buffer、1.25L 10mM dNTPs、0.5L 200U/L M-MLV和3.25 L DEPC水，经37℃ 10min、42℃ 50min、70℃ 5min合成cDNA，–20 ℃保存。

  根据文献报道及序列比对分析结果，选择并合成7对GEV-1引物作为候选引物进行PCR扩增筛选（表1）。PCR 反应体系 25 L，反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃延伸 45 s，35个循环后，72℃延伸 7 min。PCR 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物割胶回收，与T载体连接并转入大肠杆菌DH 5α，挑选阳性克隆测序验证。

  2、结果与分析

  2.1高通量测序及GEV-1病毒基因组全长扩增

  采集一株具有褪绿斑点等症状的‘蛇龙珠’葡萄（图1）老叶、老叶柄和枝条等组织部位混合取样，通过高通量测序分析共获得10345个contig。其中1个contig长6317 bp，经BLAST比对与GenBank已登录的GEV-1序列匹配度较高，与世界上已报道的两个GEV-1分离物序列同源性为89.55%和89.44%。为进一步证实该病毒在该样品中的存在，根据高通量测序获得的contig序列设计3对引物用于扩增该GEV-1分离物的基因组全长（表1）。同时采用RACE试剂盒对3’和5’末端序列进行测定。扩增产物经克隆测序，成功拼接获得GEV-1全长基因组，全长6317 nt，包含5个开放阅读框（ORFs），与已报道2个GEV-1分离物同源性分别为89.6%和89.4%。这是在我国首次发现GEV-1，将该分离物命名为GEV-1 SD-CG分离物。该分离物在进化树中与已报道的两个GEV-1亲缘关系最近，落在同一个分支，并且与黄症病毒科碗豆耳突花叶病毒属其余成员聚在1个大的分支，与其他属成员亲缘关系较远，不在一个分支，进一步证实该病毒分离物归于碗豆耳突花叶病毒属（图1）。

  但是在高通量测序中发现该‘蛇龙珠’葡萄植株中还存在葡萄斑点病毒等其他几种葡萄病毒，因此植株叶片症状与GEV-1的相关性尚无法确定，还有待于进一步研究。

  2.2 GEV-1 RT-PCR检测方法建立

  采用7对引物对‘蛇龙珠’休眠枝条样品进行RT-PCR检测，结果表明其中2对引物未扩增到目的条带，1对引物扩增到目的条带，但是同时存在非特异性扩增的杂带，还有1对引物扩增到特异性目的条带，但条带较弱，因此这4对引物扩增效果较差。其余3对引物（Set1F/1R、Set3F/3R和Set6F/6R）（表1）均成功扩增获得目标条带，条带大小分别为749、530和735 bp，且条带特异明亮（图2）。

  为进一步验证扩增序列的准确性，将3对引物PCR扩增产物回收并克隆测序，结果表明所得扩增产物序列与GEV-1对应片段匹配。3对引物所得目的片段序列与已报道2个GEV-1分离物序列同源性分别为79.6~79.5%、88.9~88.7%和92.5~92.7%。因此表明这3对引物扩增序列正确，可用于今后GEV-1的检测中，为今后该病毒的持续监测提供了可靠技术手段。