酿酒葡萄品种改良岗位
摘 要：为了解MYBF基因在葡萄黄酮醇生物合成途径中的作用，以‘品丽珠’、‘赤霞珠’和‘霞多丽’三个酿酒葡萄组织为材料，利用qRT-PCR技术测定MYBF的表达量，对其进行生物信息学和表达模式分析，同时测定果实中黄酮醇及酚类物质含量。结果显示，VvMYBF2全长为 1 152 bp，编码氨基酸383个，相对分子质量为42.52 kDa，理论等电点为5.51。该蛋白属于不稳定的亲水蛋白，无跨膜转运信号，非膜上受体，无信号肽存在，亚细胞定位预测发现该基因最可能定位在细胞质中。组织特异性分析表明在果皮、芽、叶以及卷须中表达量相对较高，qRT-PCR测定发现：MYBF基因在葡萄不同品种及组织中的表达量存在差异，以‘霞多丽’葡萄果皮中表达量最高，另外发现该基因在‘霞多丽’葡萄的多个组织上均有较高表达。果皮中黄酮醇含量与酚类物质含量变化一致，均为‘赤霞珠’葡萄显著高于其余两个品种，黄酮醇含量与VvMYBF2基因表达量存在差异。
关键词：葡萄；生信；黄酮醇；表达分析
在长期进化中，为适应生态环境，植物在生命活动中产生了一系列次生代谢物，其不仅参与植物的生长发育，且在生命活动的许多方面都起到了重要作用，可以帮助提高植物自身抗性，更好的抵御外界不良环境的侵害。另外，由于特定的生物活性和较高的药用价值，植物次生代谢物当前被广泛应用于医药、化工、食品以及农药等工业领域。
黄酮醇是植物苯丙烷代谢途径中产生的一类重要的次生代谢产物，查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)、黄酮醇合酶(FLS)等关键酶在其生物合成积累中发挥关键作用。研究显示，MYB转录因子调控黄酮醇生物合成是在转录水平上进行的，即其可以单独或与其他转录因子形成复合体来调节CHS、CHI、FLS等关键酶基因表达。AtMYB111主要在拟南芥子叶中表达，可以激活黄酮醇生物合成过程中关键基因（CHS、F3H、FLS等）的表达，促进黄酮醇的生物合成。BLANCO等通过凝胶迁移和转基因研究发现仙人掌中CcMYB12可与编码黄酮生物合成酶基因的启动子元件结合，通过激活黄酮醇生物合成基因，参与调控黄酮醇的生物合成。CAO等对桃果实进行实时荧光定量发现PpMYB15和PpMYBF1的转录水平与黄酮含量及黄酮合成酶的表达密切相关；双重荧光素酶分析表明，PpMYB15和PpMYBF1可反式激活类黄酮生物合成基因的启动子PpCHS1、PpCHI1、PpF3H、PpFLS1，调控黄酮醇生物合成及植物组织呈色。WANG等通过苹果愈伤组织中的过表达和拟南芥中的异位表达确定MdMYB22可通过直接与黄酮醇合酶启动子结合来激活黄酮醇途径。黄酮醇在植物的生长繁殖中扮演重要角色，可以调控植物呈色、参与植物生长发育以及植物应对环境胁迫反应，因其独特的生理特性和优良的生物学功能，黄酮醇成为当前的研究热点之一。
葡萄（Vitis vinifera）是公认的最古老的水果之一，其栽培面积和产量均居世界前列，在我国栽培广泛，是重要的经济作物。葡萄果实中的次生代谢物黄酮醇的含量不仅是影响其品质形成的主要因素同时对葡萄果实中的营养成分构成也起着重要作用。黄酮醇在葡萄果实中的积累以游离态和结合态两种形式进行，其可以调控果皮色泽及营养物质积累。近年来MYBF基因因与黄酮醇代谢相关而被重视，目前在甜橙、梨、苦荞等物种中均有研究，葡萄中于2009年首次报道了两个MYBF序列，STEFAN等通过瞬时报告基因分析表明VvMYBF1是黄酮醇合酶1的特异性激活子，进一步证实了VvMYBF1作为黄酮醇合成的转录调控因子的功能，VvMYBF2不同于VvMYBF1，它不存在黄酮醇调节因子特异性SG7基序，鉴于VvMYBF2的特殊性以及黄酮醇对葡萄果实和葡萄酒风味和营养上的重要贡献，我们期待分析VvMYBF2的表达模式及其在黄酮醇合成调控中的作用。
1 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料均来自山西农业大学果树研究所。所选试材为‘品丽珠’、‘赤霞珠’和‘霞多丽’3个酿酒葡萄品种，采集葡萄样品包括茎（嫩茎）、叶（嫩叶）、芽（冬芽）、花（95%开放），以及成熟期的果皮与果肉。样品经液氮速冻处理后保存于-80℃冰箱备用。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA的提取及cDNA合成
利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)进行所有葡萄样品的RNA提取。使用Eppendorf BioPhotometer D30 核酸蛋白测定仪检测提取的RNA的浓度及纯度。利用GoScript™ Reverse Transcription System（A5000）试剂盒进行cDNA第一条链的合成。
1.2.2基因序列分析
利用ExPASy软件对葡萄VvMYBF基因进行蛋白特性分析；通过在线分析工具Protscale对蛋白亲疏水性进行进一步分析；利用在线工具TMHMM进行跨膜结构域分析；应用SignaIP进行信号肽分析；在线软件NetPhos 2.0 Serve预测磷酸化位点；PSORT Prediction进行亚细胞定位预测；利用54个不同葡萄组织(GSE36128)中VvMYBF2基因的标准化转录物表达数据，构建表达热图以了解该基因的组织特异表达情况。
1.2.3 VvMYBF2基因的表达特性分析
根据VvMYBF2的ORF序列设计实时荧光定量PCR引物qF和qR (表1) 。以‘品丽珠’、‘赤霞珠’和‘霞多丽’的第一链cDNA为模板，采用qRT-PCR分析VvMYBF2的表达模式。反应体系为：cDNA模板2ul 、上下游引物各0.5μL、qPCR mix 10 ul、ddH2O 7ul。反应条件为：95℃ 预变性5min，45个循环（95℃ 变性 20s ，60℃退火30s）。
1.2.4黄酮醇及其他酚类物质含量测定
黄酮醇及其他酚类物质含量测定均采用分光光度计法，总酚和单宁含量测定采用Folin-Ciocalteu法测定，原花色素含量采用正丁醇-盐酸比色法测定，总类黄酮含量通过氯化铝比色法测定，参考WATERHOUSE等的方法测定黄烷醇含量，黄酮醇测定参照文献方法进行。
2 结果与分析
2.1 序列分析
葡萄VvMYBF2基因编码蛋白质产物一级结构经过ExPASy 软件分析，其基本理化性质如表2和图1。可知，VvMYBF2蛋白质不稳定系数超过阈值40，为不稳定的亲水蛋白质。通过在线分析工具Protscale对蛋白亲疏水性进行进一步分析（见图2A），从整体来看，亲水氨基酸（负值）稍多于疏水的（正值），该蛋白表现为亲水性。
跨膜结构分析（图2B）发现该蛋白质的氨基酸残基几乎完全在膜外，而且不存在明显的跨膜区域。由此推测VvMYBF2蛋白没有跨膜转运信号，非膜上受体。
信号肽预测见图2C，剪切位点（C值）变化较小，跨膜区域（S值）相对平稳，由此推断VvMYBF2蛋白无信号肽存在。磷酸化位点预测（图2D）分析发现该蛋白质共有29个磷酸化位点，其中丝氨酸可能的磷酸化位点最多，有20个，苏氨酸和酪氨酸可能的磷酸化位点分别为8个、1个。
为了解VvMYBF2基因在葡萄发育过程中的作用，分析其在葡萄54个不同组织中的转录组数据，由图3可知，该基因在不同组织中的表达存在较大差异，在果皮、芽、叶以及卷须中表达量相对较高，或许是参与这些组织部位的形成发育，其具体功能还需进行进一步的试验研究来验证。
2.2 VvMYBF2基因的表达分析
2.2.1 不同品种葡萄果实中VvMYBF2基因的表达量
图4显示，该基因在所检测的3个不同葡萄品种的果实中均有表达，且表达量存在差异，其中霞多丽果皮中显著高表达。除品丽珠外，VvMYBF2基因在其余两个品种的果皮中的表达量高于果肉中的表达量。在果皮表达中，‘霞多丽’葡萄中的表达量最高，分别是‘赤霞珠’和‘品丽珠’的6.9倍、15.7倍，表达差异显著；在果肉表达中，以‘品丽珠’葡萄果肉中的表达量最高，是‘赤霞珠’的2.0倍，是‘霞多丽’的1.2倍，果肉中虽表达量较低，但也存在差异。
2.2.2葡萄组织中VvMYBF2基因的表达量
荧光定量结果表明，VvMYBF2的表达量在品种及组织中均存在差异。整体上看，该基因在绿色品种‘霞多丽’的各组织中均有较高表达量，在红色品种‘品丽珠’和‘赤霞珠’中表达模式相似（图5）。叶片中，VvMYBF2在‘赤霞珠’中的表达量最高，是‘品丽珠’的2.6倍，是‘霞多丽’的1.2倍；VvMYBF2在‘霞多丽’芽中的表达量是‘品丽珠’的43.2倍，是‘赤霞珠’的15.8倍，差异极显著；该基因在花中的表达量以‘霞多丽’最高，分别是‘赤霞珠’和‘品丽珠’的15.6倍、12.7倍；茎中也是在‘霞多丽’的表达量最高，是‘赤霞珠’的2.8倍、‘品丽珠’7.3倍。VvMYBF2基因在不同品种中表达差异显著，组织表达以叶片中最高。
2.2.3果实中黄酮醇及其他酚类物质含量
采用分光光度计法测定葡萄果皮与果肉中的黄酮醇含量，测定结果如图6所示，不同品种果实中黄酮醇含量有差异，果皮与果肉中变化一致，均是‘赤霞珠’葡萄中黄酮醇含量显著高于其余两个品种，但果肉中黄酮醇含量极低，BAYDAR等人的研究与本试验结果一致，均表明黄酮醇主要存在于葡萄果皮中。
测定葡萄果实中的总酚、黄烷醇、总类黄酮、原花色素及单宁含量，结果如图7所示，‘赤霞珠’葡萄果皮中各酚类物质含量显著高于‘霞多丽’和‘品丽珠’，而果肉中各酚类物质含量较低。张娟等测定了果实不同部位的酚类物质，发现果皮中酚类物质含量显著高于果肉中，这与本研究一致。
3 讨论与结论
黄酮醇是一种生物活性化合物，可以保护植物抵抗环境的各种刺激，同时也是果实和花的颜色来源，在人体中，对人体的生物反应起修饰作用，具有抗过敏、抗炎症和抗癌性能，近年来关于黄酮醇的研究也越来越丰富。葡萄（红、黑、绿各种颜色）富含天然黄酮醇，探索其黄酮醇的合成机制及表达方式，挖掘提高果实中黄酮醇含量的途径，对保健型果品、功能性食品开发利用具有重要意义。
本研究结果表明VvMYBF2基因编码的氨基酸数目与甜橙、苦荞、甜荞等多个物种中存在差异，可能是在进化过程中出现了丢失或增长。通过qRT-PCR测定葡萄组织中VvMYBF2基因的表达量，结果与组织特异性分析结果相一致，果皮和叶片中的表达量相对高于其他组织，另外发现VvMYBF2基因在绿色品种‘霞多丽’葡萄中的表达量高于红色品种‘品丽珠’和‘赤霞珠’，果皮和叶片中的表达量相对高于其他组织，关于该基因在葡萄果实中的调控作用还有待进一步研究。
二氢黄酮醇是原花色素与黄酮醇的共同底物，植物中先合成二氢黄酮醇，在进一步合成黄酮醇与原花色素，原花色素再进一步转化为花青素。本试验中发现不同葡萄果实中原花色素与黄酮醇变化趋势一致（图6与图7B），且红色品种中两种物质含量显著高于绿色品种，猜测是红色品种中生成的二氢黄酮醇更多，因此相对合成了较多的黄酮醇与原花色素。另外红色品种中VvMYBF2的表达量与其黄酮醇含量成正比，而绿色品种霞多丽中VvMYBF2表达量最高但其黄酮醇含量却最低，或许该基因在不同品种中的表达存在差异，黄酮醇合成受多个基因调控，也可能是其他调控因子导致其黄酮醇含量的降低，还需进一步实试验探究。
VvMYBF2基因编码了383个氨基酸，在果皮、芽、叶以及卷须中表达量相对较高。VvMYBF1基因编码367个氨基酸，在浆果发育早期的芽和花中高表达，开花后表达减少，VvMYBF2也应开展发育时期的动态研究，探究发育过程中VvMYBF2表达量与黄酮醇含量的关系。VvMYBF1和VvMYBF2的研究都选择了红、白两类葡萄品种，试验数据表明MYBF在红白葡萄品种黄酮醇的合成均有贡献，对于红白葡萄品种中的差异表达仍需进一步试验探究。MYBF基因对葡萄果实黄酮醇的合成调控仍不明确，有待更丰富的研究。