制汁葡萄品种改良岗位

赵雨 郭印山 林洪 郭修武

  葡萄是世界上种植最广泛的果树种类之一，具有重要的经济价值。但在栽培过程中，其易受各类病原菌的侵染，其中霜霉病是葡萄生产中的一种主要病害，葡萄霜霉病是由葡萄单轴霉属[Plasmopara viticola (Berk. et Curtis)Berl. et de Toni.]真菌侵染引起的多循环病害，葡萄霜霉病遍及世界各葡萄产区，是葡萄生产中的重要真菌病害之一。葡萄霜霉病主要在春夏季多雨潮湿的地区流行，可以危害葡萄所有的绿色组织，包括叶片、嫩枝、卷须和浆果，其主要危害葡萄叶片，严重时叶片干枯早落，致使减产30%~50%，重者减产达80%以上。不同葡萄品种对霜霉病的抗性存在差异。欧亚种群一般不抗霜霉病，而美洲种群对霜霉病有显著抗性（刘会宁和李华， 2004；Boso & Kassemeyer，2008），起源于美洲的沙地葡萄和河岸葡萄对霜霉病有中等抗性，而圆叶葡萄则表现为免疫 （Jürges et al.，2009；Yin et al.，2017）。

  为了了解不同葡萄种质资源对霜霉病的抗性。本研究利用沈阳农业大学葡萄基地的105份不同地理来源、种群的葡萄种质资源资源进行霜霉病的抗性鉴定，为生产上筛选和栽培抗病种质资源提供参考依据。

  1 材料与方法

  1.1 试验材料

  试材取自于沈阳农业大学葡萄园试验基地，共105个葡萄品种资源，每个种质资源选取6个植株，选取的叶片为新梢顶端往下数第四，五片叶完全展开的叶片，树体栽植的方式为棚架栽培，105份葡萄种质资源鉴定材料见表 2-1。

  1.2 试验方法

  1.2.1 葡萄霜霉菌的培养与扩繁

  选取 ‘无核白鸡心’（Vitis ViniferaL .cv.‘Centennial Seedless’）从生长点顶端往下数第4-5片完全展开的叶片作为霜霉菌扩繁的材料，采集田间感染了霜霉病的叶片，带回试验室用蒸馏水冲洗后，用毛笔将叶片表面的孢子刷入无菌水中制成孢子悬浮液，在血球计数板上用显微镜观察孢子密度，密度合适以后放置备用，将培养皿铺上两层滤纸，滤纸与培养皿的大小均为15cm，将滤纸润湿，然后将‘无核白鸡心’的叶片背面朝上放到培养皿中，将之前制备好的孢子悬浮液用小型喷雾器往叶片上喷，每次喷一元钱硬币大小的区域，每个区域喷两次，直到喷满整个叶片，而后置于人工智能气候培养箱（mLR-352H-PC，Panasonic）内（22 ℃，3 Ls，16 h; 22 ℃，0 Ls，8 h）培养7-9 d，使其叶背表面长满霜霉菌孢子梗。扩繁所得的葡萄霜霉菌可用于种质资源接种鉴定试验。

  1.2.2 葡萄霜霉菌孢子悬浮液的配置

  用毛笔将‘无核白鸡心’扩繁所得的葡萄霜霉菌孢子刷于无菌水中，将其滴于25×16型的血球计数板上，将孢子悬浮液放置在万能显微镜（BX51）下进行浓度的观察，以最终配置成密度1×105（孢子数 mL-1）孢子悬浮液放置备用，以此浓度下的孢子悬浮液接种的效果最好。

  1.2.3 试验种质资源葡萄霜霉病接种

  材料准备:室内接种试验用叶盘法（Unger et al., 2007）。取供试单株新梢上从生长点顶端往下数第4-5片完全展开的嫩叶，取回试验室用无菌水清洗干净，吸干表面的水分，然后用直径为25 mm的打孔器在每个单株的叶片上打30个叶圆盘，然后将培养皿铺上两层滤纸，滤纸与培养皿的大小均为15 cm，将滤纸润湿，把叶圆盘放到培养皿里面，叶背朝上整齐摆放，每个培养皿里面放10个叶圆盘。采用将孢子悬浮液喷洒在叶片背面的侵染方法，在小型手持喷雾器喷洒里面装上提前配好的浓度适宜的孢子悬浮液，每个培养皿喷洒2.5 mL，并在人工智能气候培养箱（mLR-352H-PC，Panasonic）内（22 ℃，3 Ls，16 h; 22 ℃，0 Ls，8 h）培养9 d后进行抗性分级鉴定与数据统计。

  1.2.4 试验葡萄种质资源霜霉病抗性分级

  种质资源接种霜霉病孢子悬浮液9 d之后统计葡萄霜霉菌孢子梗在叶圆盘上所占面积，根据病斑面积占叶圆盘的百分比对种质资源进行霜霉病抗性的分级鉴定（Liu et al., 2015），计算统计每个叶圆盘的发病状况，最终计算出病情指数。分级标准如下：无病斑为0级，0 %<病斑面积≤2.5 %为1级，2.5 %<病斑面积≤5 %为2级，5 %<病斑面积≤15 %为3级，15 %<病斑面积≤30 %为4级，30 %<病斑面积≤50 %为5级，50 %<病斑面积≤70 %为6级，70 %<病斑面积≤85 %为7级，85 %<病斑面积≤95 %为8级，95 %<病斑面积≤97. 5 %为9级，97.5 %<病斑面积≤100 %为10级。分级完成后按照以下公式利用Excel2016计算出霜霉病在各个葡萄种质资源表现的病情指数。

  依据病情指数，参照刘崇怀（2006）方法将种质资源霜霉病抗性表现分成5个级别：无病斑为免疫，0<病情指数≤5为高抗，5<病情指数≤20为抗，20<病情指数≤40为中抗，40<病情指数≤60为感病，60<病情指数≤100为高感。

  1.2.5 数据处理分析

  用Excel 2016软件进行试验数据处理，采用SPSS 19.0，origin 2018，R/Performance Analytics软件进行数据处理分析，使用ZEN软件进行图片处理。

  2 结果与分析

  2.1 葡萄霜霉菌扩繁培养结果

  图 1 为接种霜霉病菌扩繁9 d时的‘无核白鸡心’叶片，霜霉病菌在‘无核白鸡心’叶片上长势良好，证明试验所用葡萄霜霉菌侵染能力与活力均正常，可以用于种质资源侵染试验，图 2为葡萄霜霉病菌孢子密度，试验所需浓度为1×105（孢子数 mL-1）。

  2.2 葡萄种质资源霜霉病抗性鉴定结果

  利用105份葡萄种质资源叶片进行室内离体接种，采用离体人工喷施孢子悬浮液的鉴定方法，对105份葡萄种质资源进行抗霜霉病抗性鉴定，图 3为部分种质资源叶片接种霜霉病孢子悬浮液9 d时的发病状况，从图表上可以看出，不同葡萄种质资源对霜霉病的病情指数（DI）分布在1.21-83.7之间。在105份种质资源中，一共10份材料表现为高抗（HR），表现为抗（R）的材料有17份，表现中抗（MR）材料有23份，表现为感病（S）的材料有37份，表现为高感（HS）有18份材料。

  由表 1可知，供试所有种质资源中不存在免疫类型。在10份中国野生葡萄种质资源中，高抗种质资源有3份，为‘双优’，‘双红’，‘左山一’，抗病种质资源4份，为双庆，双丰，左红一，刺葡萄，中抗种质资源有2份，为老君山桦叶，秦岭桑叶，1份高感病种质资源左山二。 在13份来源于美洲的葡萄种质资源中，高抗种质资源有7份，为河岸一号，‘自由’，‘SO4’等，抗病种质资源3份，河岸九号，沙地葡萄，‘康可’，中抗种质资源2份，为‘贝达’，‘LN33’，以及1份感病种质资源，为甜冬葡萄。 在4份欧山杂种葡萄种质资源中，抗病种质资源有2份，为‘北国红’，‘北红’，高感种质资源2份‘公酿1号’，‘左优红’。在42个欧美杂种葡萄中，有抗病种质资源6份，为‘布朗无核’，‘黑色甜菜’，‘白香蕉’，‘火星无核’等，中抗种质资源11份，感病种质资源16份; 在36份欧亚种葡萄中，有抗病种质资源2份，中抗种质资源8份，感病种质资源20份。全部材料中高抗，抗病和中抗种质资源占总份数的50.47 %。

  图5为霜霉菌孢子悬浮液侵染部分种质资源叶片9 d时感病状况，可以看出不同种质资源的葡萄叶片抗霜霉病能力呈现出了较大差异。

  3 讨论与结论

  通常室内接种和田间接种为鉴定不同葡萄种质资源资源对霜霉病的抗性的常用方法（刘天明 等，2001; 房玉林 等，2007; Blasi et al., 2011）。为了保持环境条件一致，本研究以105份葡萄种质资源资源为试材，采用室内离体叶片接种法对试材进行葡萄霜霉病的抗性鉴定。结果发现不同葡萄种质资源资源对葡萄霜霉病抗性存在明显差异。这一结果与Wan（2007）的研究结果相似，其原因可能是由育种过程中人工选择，不同的起源地或功能基因的不同作用导致的种间差异（Pandey et al., 2009），在105份试材中，感病与高感个体多为欧亚种，这与张振文（1996）等研究结果一致。有学者认为欧美杂种较抗霜霉病（Boso Alonso et al., 2008），本研究内的15份欧美杂种葡萄资源对霜霉病均表现为中抗，有9份欧亚种资源也表现为中抗，河岸葡萄和沙地葡萄表现为抗病或者高抗，这与刘延琳（1997），Staudt（1995）等的研究结果相近。本研究发现部分种质资源的表现比前人的鉴定结果更感病，可能与室内离体叶片接种法环境条件更适合霜霉病生长有关。

  本研究大部分的抗病种质资源为原产中国的野生资源以及北美种群野生种，少部分为欧亚种为欧美杂种，且欧美种较欧亚种占了更大比例，大部分的中抗种质资源为欧美杂种和欧亚种，且欧美杂种较欧亚种占了较大比较，仅有少数几份地理来源为中国和美洲的葡萄种质资源为中抗，大部分感病的种质资源为欧亚种和欧美杂种品种，且欧亚种占了较大比例。