贺兰山东麓综合试验站

姜彩鸽 王国珍 宋双 张怡

  宁夏贺兰山东麓地区是全国最大的葡萄酒地理标志保护产区，随着葡萄种植面积不断扩大，单一的生态环境的持续，有害生物的生态适应性也不断提高，葡萄灰霉病已成为贺兰山东麓葡萄产业重大病害之一，主要造成成熟期果实腐烂，据调查，不同年份造成不同品种的产量损失约20%～50%。对于该病害的防治，生产上仍以化学防治为主，且化学用药水平也在逐年提高。我国灰霉病化学防治中常用杀菌剂品种为苯并咪唑类的多菌灵、二甲酰亚胺类的腐霉利和异菌脲、苯胺基嘧啶类的嘧霉胺以及N-苯氨基甲酸酯类的乙霉威等。2013年啶酰菌胺和啶菌噁唑在我国登记用于灰霉病的防治。而引致葡萄灰霉病的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）具有寄主范围广、产孢量大、再侵染频繁、遗传变异大和适合度高的特性，特别是在对该病的防治中单一化学杀菌剂的长期反复使用，极易产生抗性，国内外已有大量报道表明灰霉病菌对这些药剂产生了不同程度的抗性，因此，定期对灰霉病菌进行抗药性检测是灰霉病综合治理中的必要措施。

  本研究以宁夏农垦、青铜峡市、园林场部分果园葡萄灰霉病菌为对象，采用孢子萌发测定法，就其对目前生产上常用和新引入杀菌剂进行敏感性分析，旨在掌握葡萄灰霉病菌对供试杀菌剂的抗药性水平，为我区葡萄生产中延缓病菌抗药性发展和精准用药提供科学依据。

  1 材料与方法

  1.1 供试菌株

  葡萄灰霉病菌采自贺兰山东麓葡萄主栽区常规施药葡萄园，经分离单孢纯化后转入斜面，保存于4℃冰箱中待用。

  供试药剂除多菌灵用0.1mol/L HCL溶液溶解外，其余均用丙酮溶解，配制成1.0×104 µg/mL的母液，加入0.2乳化剂Tween-80，置4℃冰箱中贮藏备用。用时以无菌水稀释至设定浓度，以药剂与培养基(水琼脂培养基)1:9的比例制成含最终所需浓度药量的水琼脂平板（培养基冷却至 45℃左右时加入药剂），进行敏感性测定。

  1.3 检测及调查方法

  参照潘金菊方法采用孢子萌发法测定。用灭菌去离子水洗脱、过滤得到的孢子悬浮液，调至100倍显微镜下每视野30-40个孢子。分别加入供试药剂，制备质量浓度为20、50、100µg/mL的含药水琼脂平板，取100 µL孢子悬浮液加在平板中央，用涂布棒将孢子悬浮液涂布均匀，置21℃恒温培养箱黑暗条件下培养12 h，显微镜下调查分生孢子萌发状况，计算分生孢子萌发抑制率。

  1.4 数据处理

  分生孢子萌发抑制率=〔﹙对照分生孢子萌发率－药剂处理分生孢子萌发率﹚/对照分生孢子萌发率〕×100按上述公式用Excel及DPS软件统计不同药剂浓度的分生孢子萌发抑制率，并进行系列药剂浓度的对数值（х）与孢子萌发抑制率的几率值（у）之间的线性回归分析，求出各药剂抑制灰霉病菌分生孢子萌发的毒力回归方程、相关系数及有效抑制中浓度（EC50）。

  1.5 灰霉病菌抗药性水平判断标准

  葡萄灰霉病菌的抗药性水平判定采用标准见（表3），抗药性水平的判定依据Zhang、赵建江、陈治芳、马建英所报道的敏感基线值进行判别。

  2 结果与分析

  2.1 供试药剂对葡萄灰霉病菌孢子萌发抑制分析

  供试药剂对葡萄灰霉病菌孢子萌发抑制情况见表4。由表4可见8种药剂以吡啶胺类-98%氟啶胺抑菌效果最好，孢子萌发平均抑制率达98.73%，最高抑制率达100%；其次是酰胺类-97%啶酰菌胺，平均抑制率达87.38%，最高抑制率达93.26%；再次是吡咯类-98%咯菌腈，平均抑制率达85.82%，最高抑制率达90.57%。生产中常用杀菌剂腐霉利、乙霉威、嘧霉胺对葡萄灰霉病菌孢子萌发平均抑制率均在60%以下，其中上述3种药剂（腐霉利、乙霉威、嘧霉胺）对宁夏农垦所获菌株的孢子萌发抑制率较低，腐霉利46.47%、乙霉威32.26%、嘧霉胺34.11%；对青铜峡所获菌株的孢子萌发抑制率分别为73.42%、63.48%、73.77%；对园林场所获菌株的孢子萌发抑制率分别为57.29%、73.76%、60.13%；多菌灵是自葡萄种植以来生产中最常使用的杀菌剂，由表4也可见其对灰霉病菌孢子萌发的平均抑制率只有18.58%，三个区域的最高抑制率为31.48%，最低抑制率3.42%，说明该药剂对三个地区葡萄灰霉病防效甚微。

  2.2 葡萄灰霉病菌对4种常用药剂的敏感性分析

  从表5、6可见：三地所获菌株对多菌灵、腐霉利、乙霉威、嘧霉胺4种农药主要有高抗（HR）和中抗（MR）2种类型。供试菌株对多菌灵在宁夏农垦、青铜峡及园林场的EC50值分别为171.4796µg/mL、349.7358µg/mL、287.6913µg/mL，均高于判定标准50µg/mL，表现为高抗类型（HR）；腐霉利园林场果园所获菌株的EC50为96.1191µg/mL， >判定标准高抗菌株的50µg/mL，说明所获菌株为高抗类型，宁夏农垦果园所获菌株对腐霉利的EC50为48.2849µg/mL，青铜峡果园所获菌株对腐霉利的EC50为32.5809µg/mL，两地菌株10µg/mL≤EC50值<50µg/mL均为中抗类型（MR），但宁夏农垦菌株已接近高抗临界值；乙霉威对宁夏农垦所获菌株EC50值67.5133µg/mL，>判定标准高抗菌株的50µg/mL，为高抗类型（HR），青铜峡和园林场的10µg/mL≤EC50值<50µg/mL，均为中抗类型（MR）；嘧霉胺对三个地区供试菌株EC50值均高于判定标准的3.64µg/mL，均为高抗类型（HR），所获菌株是否与多菌灵菌株具有交互抗性尚待深入研究，但建议药剂不要交替使用。

  2.3葡萄灰霉病菌对4种新型药剂的敏感性分析

  从表7、8可见：三个地区供试菌株对4种新型药剂的敏感性较好，抗性类型主要为敏感型（S）和低抗型（LR）。其中啶酰菌胺的EC50分别为8.8525µg/mL、10.8023µg/mL、13.1507µg/mL，宁夏农垦菌株EC50值<10.7µg/mL，为敏感型（S）；青铜峡、园林场菌株10.7µg/mL≤EC50值<53.5µg/mL，为低抗型（LR）；三个地区供试菌株对咯菌腈的EC50值较低，其中青铜峡整体EC50值低于0.135µg/mL，为敏感型；宁夏农垦和园林场的菌株0.135µg/mL≤EC50值<0.675µg/mL，均为低抗型（LR）；对氟啶胺的EC50值为0.1846µg/mL，均为低抗型（LR）；三个地区供试菌株对啶菌噁唑的1.182µg/mL≤EC50值<5.91µg/mL，也均为低抗型（LR）。

  3 讨论

  灰霉病菌具有寄主广泛、产孢量大、易变异等特点，是具有高抗药性风险 的病原真菌。国内外研究也表明，通过持续跟踪调查病原菌对不同药剂敏感性，能够有效地指导生产中精准施药，为减药控害提供科学依据。

  以贺兰山东麓三地葡萄灰霉病菌对8种药剂敏感性初测表明：常用杀菌剂多菌灵不仅对三地葡萄灰霉病菌孢子萌发抑制率较低，同时三个地区的供试菌株对该药剂敏感性较差、均表现为高抗类型，因此建议生产中不再选用该药剂作为防治灰霉病的药剂。

  腐霉利、乙霉威、嘧霉胺是继多菌灵后防治果蔬灰霉病的常用药剂，已在不同葡萄种植区使用十余年，不同区域、不同果园防效不一，试验结果表明，长期使用嘧霉胺药剂防治葡萄灰霉病的果园，对该病原菌已形成较高的选择压力致使其对药剂的敏感性降低、抗药性增强，建议在减少该药剂使用的前提下与其他无交互抗性的药剂交替使用；腐霉利、乙霉威在三个区域表现不一，但初测表明，三地所获菌株均具有抗药性趋于增强的态势。

  从三个地区供试菌株对新型药剂的敏感性测定表明，供试药剂不仅对供试菌株均有较高孢子萌发抑制率，同时毒力也较高，供试菌株主要表现为敏感性和低抗型，可考虑选择吡啶胺类吡啶胺类（氟啶胺）、酰胺类（啶酰菌胺）、吡咯类（咯菌腈）作为生产中葡萄灰霉病防治的交替药剂，以缓解其它药剂防效下降的情况，从而达到葡萄灰霉病菌对常用药剂产生抗性的治理。

  综合以上分析，虽然试验中发现葡萄灰霉病菌对常用药剂具有很高的抗药性，但由于本研究中检测的菌株数量较少，尚不足以代表贺兰山东麓地区的抗药性水平，因此就整个地区的抗药性情况还待今后持续深入研究。