无核种质材料创制岗位

徐炎 张剑侠 张朝红 王跃进

  葡萄种子败育受基因的调控，通过前人研究认为无核葡萄的遗传机理为一个显性基因SDI（Seed Development Inhibitor）调节三个独立的隐性基因。通过QTL研究，将控制无核性状的SDI基因位点共定位在第18号染色体上。因此SDI基因位点上的几个候选基因成为研究重点。通过功能分析，最后确定了完全控制葡萄无核的转录因子基因VviAGL11，且该基因为胚珠识别中的特异基因。因此，我们对该基因的基因序列在无核葡萄无核白和红宝石无核以及有核葡萄黑比诺和红地球中进行了序列克隆与分析。

  根据文献中提供的同源基因VviAGL11的登录号（GSVIVT01025945001）在欧洲葡萄基因组网站（http://www.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）中找到序列后，分析该基因的DNA序列全长为7850bp，有8个外显子和7个内含子。同源基因克隆时，将基因分为6段克隆。从选取的不同品种的叶片中，通过CTAB法提取总DNA，将参考的基因序列分段通过primer 6.0软件设计引物，用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa）进行PCR扩增，产物经rTaq酶加A后，将扩增的目的基因片段转入PMD-19T克隆载体中，通过热击法转化到克隆菌株Top10感受态细胞中，菌液PCR检测获得阳性克隆后送公司测序。测序后的6个大小不同的基因片段序列通过DNAMAN软件对序列进行比对和拼接，将获得的全长序列与GenBank网站上（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）登录的VviAGL11转录因子基因的DNA序列（KM401845.1，KM401846.1，KM401847.1，KM401848.1）进行比对，序列结果基本一致，在无核葡萄和有核葡萄中存在单个碱基突变。将其编码区的序列翻译成氨基酸序列后，比对无核葡萄和有核葡萄的氨基酸序列，发现在197位置上有核葡萄中为精氨酸（R），无核葡萄中为亮氨酸（L），这一结果与前任研究报道一致。所以葡萄中种子败育是由于该位置的碱基突变引起的，这一结果为揭示无核葡萄形成机理鉴定了基础。下一步研究工作是围绕种子败育型葡萄种子发育进程中的败育基因为主线，进行扩展研究，获得主要的与相关的葡萄果实发育中的表现的无核基因。