种质资源收集与评价岗位
王富强 李贝贝 樊秀彩 张颖 姜建福 刘崇怀
摘 要：以76个葡萄品种为材料，从137个SSR标记中选出30个扩增结果稳定、多态性高、退火温度一致且在染色体上均匀分布的SSR标记；使用‘赤霞珠’‘霞多丽’和‘红地球’3个品种验证了30个标记的稳定性和可靠性，并确定‘霞多丽’‘红地球’为参照品种；聚类分析结果与52个品种的系谱关系基本一致；仅用VMC4F3-1标记可区分25个品种，最多使用8个标记可完全区分52个品种。从137个葡萄标记中筛选出30个标记，构建了一套适用于中国的葡萄SSR分子标记体系，同时为保证鉴定效率和国际品种鉴定接轨，选择VVMD28、VVMD32、VVMD27、VrZAG79、VVMD7、VrZAG62、VVMD25、VVS2、VVMD5这9个标记作为体系的核心引物，其他标记作为扩展引物。
近年来，SSR标记技术以其多态性高、稳定性强、操作简单、对DNA质量要求低等优势，成为当前品种鉴定的主要技术。国外研究者Thomas M R、Bowers J E、Sefc KM等分别报道了9个适合葡萄品种鉴定的SSR标记，现已成为国际上葡萄品种鉴定的通用标记。尹玲、杨航宇、李贝贝等也利用国际通用的SSR标记分别构建了不同份数的葡萄品种遗传图谱，而国际上的葡萄品种以欧亚种为主，中国作为世界葡萄东亚种群的集中分布区，拥有我国丰富且独特的种质资源，仅靠国际上的几对标记已无法区分中国的葡萄品种。此外，随着我国育成葡萄新品种数量与葡萄品种资源管理需求的日益加剧，国内急需要开发一套适用于中国的葡萄SSR标记鉴定体系。
2016年，《葡萄品种鉴定SSR分子标记法》被列为农业行业标准制定项目，在相关项目的支持下，本研究试图筛选一套符合我国葡萄品种鉴定标准的SSR分子鉴定体系，为国内葡萄新品种保护、品种登记和市场维权等提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
76个葡萄品种采自国家果树种质郑州资源圃。其中24份代表品种具备不同种性、不同倍性、不同用途等特点，其余52份材料为近年来新育成品种（表1）。选取葡萄2-4片幼嫩叶片，用锡箔纸包装和区别标记，液氮冷处理8-10 min，保存在-80°C超低温冰箱备用。使用艾德莱生物公司的CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒，提取叶片DNA，并用超纯水将浓度稀释至50 ng•μL-1，-20℃保存备用。
1.2 SSR标记选择和PCR扩增
选用的标记全部来自葡萄上已报道的相关标记。引物由上海生工生物工程公司合成，含有HEX和6-FAM两种荧光探针的引物由北京阅微基因技术有限公司合成。PCR反应使用20 μL体系：10×PCR Buffer（Mg2 + plus）2.0 μL，dNTP（25 mmol•L-1）2.0μL，F-primer（10 μmol•L-1）1.0μL，R-primer（10 μmol•L-1）1.0μL，Taq 酶（5 U•μL-1）0.2 μL，DNA模板（50 mg•L-1）1 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，50℃-58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个cycles；72℃延伸10min。具体退火温度依据设计的进行筛选，若杂带、伪带较多，应适当提高退火温度，若条带很弱或空白降低退火温度。
1.3 PCR产物检测
初选扩增的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳25-30 min（恒压130V），使用凝胶成像仪拍照记录。
复选时利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。在PCR扩增产物中加入5 μL6×Loading Buffer混匀，采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，银染，观察条带并记录数据。标记精选和验证时用ABI 3730XL全自动基因分析仪检测PCR产物。检验前将每个孔位加入PCR产物1.0 μL、分子质量内标和甲酰胺混合液（0.5:8.5）9 μL；95℃变性3 min。
1.4 标记验证
选择‘赤霞珠’‘霞多丽’和‘红地球’为试材，将精选出的标记分别送至北京阅微基因有限公司和苏州金唯智生物科技有限公司进行毛细管电泳检测（ABI3730XL），验证标记使用的一致
性和稳定性。
1.5 参照品种的确定
参照品种的选择原则：样品内不同个体间一致性高，容易扩繁保种，尽量以最少的品种数量代表最多种的基因型。结合国内葡萄生产实际，确定几个常见且代表性强、无性系数量少的参照品种，反复检测并确定各标记的参照等位变异片段大小，用于校正和消除不同仪器、不同试验批次等引起的误差。
1.6 数据处理与统计分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳：估读条带清晰、多态性高的电泳图，有条带记为‘1’，空白记为‘0’，缺失记为‘999’。荧光毛细管电泳： 使用GeneMapper ID v3.2软件（美国应用生物系统公司）读取片段大小，以Excel形式导出，并对所得的荧光数据进行人工分析和校正，有峰记为‘1’，无峰记为‘0’，缺失数据记为‘999’，形成‘1/0’矩阵。使用Excel 2019计算变异等位基因的个数、基因型及在群体中发生的频率；利用PIC-CALC Version0 . 6 软件计算多态性信息含量值PIC；利用软件NTSYS-pc 2.10，采用非加权组平均法（UPGMA），对检测的数据进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 SSR标记的筛选
先用‘ 霞多丽’ ‘ 红地球’ ‘ 夏黑’ ‘ 巨峰’ ‘ 康可’‘贝达’6个葡萄材料，对137个SSR标记进行PCR扩增及2%琼脂糖凝胶电泳检测，其中120个SSR标记扩增出目的片段，初步筛选出84个条带多样且清晰的SSR标记。再用表1中的24份代表品种材料对初选出的84个标记进行PCR扩增及8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从中筛选到38个多态性高、带型清晰、退火温度相对一致且保证在每条染色体都有分布的标记（图1），占筛选标记总数的27.7%。最后对表1中其余的52份新品种材料使用复选出的38个标记进行PCR扩增，结合毛细管电泳检测技术，经数据统计处理和核对电泳检测成像图谱后，确定出30个扩增稳定、多态性信息含量（PIC）不低于0.4、退火温度控制在56-58℃、均匀分布在染色体上的葡萄SSR标记（表2），占总标记数的21.9%。
2.2 聚类分析及亲缘关系分析
利用NTSYS-pc 2.10软件，根据各品种之间的遗传相似系数，采用UPGMA法对52份葡萄品种进行聚类分析(图2)。聚类结果显示：52份品种之间的遗传相似系数在0.76-0.96，遗传相似系数为0.76时，52个品种可以分为2个大类。
第一大类：全部为二倍体品种，具体在遗传相似系数为0.78时，可以划分为三个亚类。第一亚类：‘野酿2号’，属于毛葡萄属。第二亚类：‘抗砧5号’，属于种间杂种。第三亚类：是遗传关系最复杂和信息最丰富的一个亚类，包含2个山欧杂种、4个欧美杂种和33个欧亚种。可将这39份品种分为6组：第1组有‘着色香’和‘碧玉香’两个品种，为欧美杂种，均来源于辽宁省盘锦市大洼区唐家镇刘家村，亲缘关系较近而聚在一起。第2组有‘郑艳无核’‘庆丰’和‘郑美’三个品种，其中‘郑艳无核’和‘庆丰’同为‘布朗无核’和‘京秀’的杂交后代姊妹系，亲缘关系更近，遗传相似性较高，而‘郑美’的亲本为‘郑州早红’和‘美人指’。追溯更深一步的遗传系谱关系，可知‘郑艳无核’‘庆丰’和‘郑美’均有玫瑰香的遗传特性，这也解释了这三个品种聚在一起的可能原因。第3组有22个品种，均能找到‘红地球’或‘玫瑰香’，甚至是两个品种杂交的遗传特性。
其中‘郑葡1号’和‘郑葡2号’同为‘早玫瑰’和‘红地球’的杂交后代姊妹系而聚在一起；‘短枝玉玫瑰’‘玉波二号’和‘玉波一号’也出自同一杂交姊妹系后代；‘丽红宝’‘无核翠宝’‘秋黑宝’‘早康宝’和‘翠香宝’5个品种单独聚在一起，均为山西省农科院培育的‘宝’系列，亲本之一均为‘瑰宝’；而‘福园’‘夏至红’‘玉珍香’‘凌丰红’‘玉波黄地球’等品种也聚在其中，可能与含有‘红地球’系和‘玫瑰香’系的亲缘关系有关。第4组有‘红美’和‘水晶红’，亲本之一均为‘美人指’，单独聚在一起。第5组有8个品种，其中‘红艳香’和‘华葡紫峰’的亲本之一均为‘87-1’，也单独聚在一起；其他6个品种均是从国外引种过来的新品种，部分品种的亲本无法追溯，这几个品种可能存在某种遗传相似性。第6组有‘红特沙’和‘卓越黑香蜜’，其中‘红特沙’的亲本之一‘里扎马特’和‘卓越黑香蜜’的亲本之一‘金手指’均为欧亚种，可能与其果粒均有长粒型的遗传特性有关而聚类在一起。
第二大类：共有11个品种，全部为多倍体品种，均含有‘巨峰’系亲本的遗传基因。其中，‘瑞峰’首先与其他品种区分开，可能与亲本‘峰后’和‘沈阳玫瑰’的亲缘关系同其他多倍体品种稍远有关。而‘春光’和‘蜜光’两个品种，同为‘早黑宝’和‘巨峰’杂交后代姊妹系，亲缘关系最近，其遗传相似系数较高。‘瑞紫香’和‘红蜜香’均来自同一单位育成的新品种，也聚类在一起。
2.3 品种鉴别效率
参照薛华柏等的SSR数据处理方法， 构建5 2 个葡萄新品种的DNA指纹图谱， 经过比对分析得出：使用国际上通用的9 个标记（VVMD28、VVMD32、VVMD27、VrZAG79、VVMD7、VrZAG62、VVMD25、VVS2、VVMD5）只能区分开43个品种；而仅用VMC4F3-1标记可区分开25个品种；使用VMC4F3-1、VVS2和VrZAG79三个标记组合能够区分开44个品种；最多使用8个标记组合（VMC4F3-1、VVS2、VrZAG79、Vchr9b、Vchr4a、VrZAG62、VVMD27、Vchr13b）可以把52个品种完全区分开（图2）。
3 结论
通过初选、复选、精选、验证等过程，最终从137个标记中筛选出30个葡萄SSR标记，构建了一套适用于中国的葡萄SSR分子标记体系，其中为保证鉴定效率和国际品种鉴定接轨，选择VVMD28、VVMD32、VVMD27、VrZAG79、VVMD7、VrZAG62、VVMD25、VVS2、VVMD5这9个标记作为体系的核心标记。