种苗扩繁与生产技术岗位
王军
在葡萄栽培中，砧木的使用是一项十分独特的农艺措施，在生产实践中广泛应用。葡萄砧木的研究利用始于根瘤蚜发现以后，此后，不同砧木对接穗的物候期、生长发育、果实品质、光合速率及葡萄酒品质的影响相继展开。众多研究表明，砧木对接穗表型性状、经济性状、生理生化特点、基因表达都有不同程度的影响。Jin等发现砧木通过影响果实阳离子和游离氨基酸的含量来改善果实的营养和风味。香气含量和香气成分受砧木的影响较大，Beta显著提高了总香气挥发物和酯类化合物的含量，而SO4则相反。陈湘云发现刺葡萄、5BB可以明显提高接穗的叶面积，增强光合作用，有利于生长结果，可加强接穗对真菌病害的抵抗力。另有研究发现，用不同砧木嫁接统一品系的‘赤霞珠’，光合速率也有显著差异。CS-169/SO4组合8月份光合速率最高，而CS-169/1103P组合9、10月份光合速率最高。Wangyu等的研究发现砧木Ganzin 1抑制了浆果果皮中黄烷-3-醇的积累；101-14、5A、5BB、Ganzin 1、Harmony、Riparia Gloire和SO4降低了表儿茶素-3-O-醇盐的浓度和比例，5A、Harmony和Riparia Gloire增强了黄酮醇的浓度； SO4略微降低了大部分单体花色苷的浓度。另有研究表明，嫁接到SO4砧木上的美乐葡萄与嫁接其他砧木的美乐葡萄相比，其果皮和种子中的花色苷浓度较高，而嫁接到砧木Gravesac上的美乐葡萄的果皮和种子中花色苷浓度显著偏低。Satisha等将ThompsonSeedless葡萄嫁接到5种砧木上，发现不同砧木嫁接葡萄果实的黄酮醇总量均显著高于自根苗。‘巴贝拉’葡萄嫁接在Rupestris dulot上，总酚和花色苷含量比‘巴贝拉’/5BB和‘巴贝拉’/41B两个砧穗组合要高。
由此可见，不同砧木对葡萄品种的多种品质指标和光合速率都是有影响的。目前关于适合‘赤霞珠’的砧木目前还没有明确的结论，因此，本试验利用1103P、SO4、5A等三种砧木对‘赤霞珠’进行嫁接，旨在筛选出果实品质相对较好的砧穗组合。
1 材料和方法
1.1 试验材料
本试验地点位于北京市海淀区白水洼路（40.14 °N，116.19°E）中国农业大学上庄试验站，试验地为平地。试验中‘赤霞珠’所嫁接的砧木分别为1103P、SO4和5A，以‘赤霞珠’自根苗作为对照；各砧木亲本信息如表1所示。
‘赤霞珠’均为南北行向，行距和株距分别为2.5 m和1.2 m，篱架，树形为倾斜式单龙干，叶幕形为改良的VSP，叶幕高度和宽度持保持在约120 cm和70 cm，留梢量为12.5支/延长米，葡萄园管理（灌溉、施肥和病虫害控制等）均按照相同的标准进行。
1.2 实验试剂
乙酸钠（分析纯）、甲醇（分析纯）、二氯甲烷（分析纯）、丙酮（分析纯）：北京化工厂；类黄酮标准品，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，Sigma 公司（St. Louis, MO,USA）；乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）：Fisher 公司（Hampton, USA）；固相萃取柱 Cleanert PEP-SPE（150mg/6 mL）：Bonna-Agela 科技公司（Wilmington, DE, USA）。
1.3 仪器与设备
FD-1C-50 冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；RE-52AA 离心机：赛默飞世尔公司；美国 Agilent 公司；Agilent 1200 系列配有可变波长检测器（VWD）的高效液相色谱串联Bruker 系列离子阱质谱联用仪：美国 Agilent公司； Agilent 6890 GC 和 Agilent5975 MS 气相色谱与质谱联用仪（GC-MS）：美国 Agilent 公司；Agilent 1100 系列配有二极管阵列检测器（DAD）的 LC/MSD Trap-VL 高效液相色谱-离子阱质谱联用仪。Li-6400光合仪。（北京力高泰有限公司）
1.4 试验方法
1.4.1 果实理化指标的检测
选择无物理性损伤、发育正常的果实采收，兼顾果穗曝光面和背光面，每个生物学重复采集约300粒浆果，液氮迅速冷冻，保存于-80℃冰箱备用。百粒浆果质量用电子天平（精度0.01 g）称量。取50粒葡萄，充分挤压出汁后，利用手持糖度计测定葡萄汁的可溶性固形物含量。取上汁，采用pH计测pH。采用电位滴定法测定样品的可滴定酸含量。根据氢氧化钠溶液的用量计算样品中的可滴定酸含量，结果以酒石酸含量计，计算公式为：
其中：浓度单位为g/L 葡萄汁，CNaOH为经过邻苯二甲酸氢钾标定的氢氧化钠溶液浓度（mol/L）；V0为以蒸馏水为空白进行实验时消耗氢氧化钠溶液体积（mL）；V1为样品滴定时消耗氢氧化钠溶液体积（mL）；V2为吸取样品的体积（mL），0.075为当以酒石酸含量计结果时采用的系数。
1.4.2 葡萄果皮花色苷和黄酮醇的提取与测定
花色苷和黄酮醇提取方法，具体方法如下图所示：花色苷提取液经0.22μm水系膜过滤后，采用Agilent 1100系列LC/MSD Trap-VL液相色谱-离子阱-质谱联用仪分析葡萄果实样品中的花色苷。色谱柱为Kromasil100-5C18（250 × 4.6mm），柱温为50℃，进样量为30μL，检测波长为525nm。流动相A: 水：甲酸：乙腈=92：2：6（v/v/v），流动相B:水：甲酸：乙腈=44：2：54（v/v/v）。流速为1 mL/min，洗脱程序为：0-1 min，0-10% B；1-18 min，10%-25% B；18-20 min，25% B；20-30 min，25%-40% B；30-35min，40%-70% B；35-40 min，70%-100% B。ESI离子源，扫描范围为100-1500 m/z，正离子模式；雾化器压力为30 Psi；干燥器流速为10 L/min；干燥气温度为325℃。每个样品重复进样两次。
黄酮醇提取液经0.22 μm水系膜过滤后，采用Agilent 1200系列LC-UV高效液相色谱仪串联Bruker系列的离子阱对黄酮醇进行检测。色谱柱为ZorbaxEclipseXDB-C18（250×4.6mm），柱温为40°C，进样量为5 0 μ L ， 检测波长为360 nm。流动相A: 乙腈：甲酸：水=5:8.5:86.5（v/v/v），流动相B ： 乙腈： 甲醇： 甲酸： 水=25:45:8.5:21.5（v/v/v/v）。流动相流速为0.63 mL/min，洗脱梯度程序为：0-24.2 min，0-14.2% B；24.2-27min，14.2%-15.7% B；27-33.4 min，15.7%-18.8% B；33.4-39min，18.8%-23.5% B；39-45 min，23.5%-26% B；45-47 min，26%-
27.4% B；47-51.6 min，27.4%-32%B；51.6-61.8 min，32%-40% B；61.8-67.8 min，40%-100%B；67.8-78.4 min，100-0% B。ESI离子源，扫描范围：0-1000 m/z，负离子模式；雾化气压力为207 kPa；干燥气流速为10 L/min；干燥气温度为325℃；CID的MS/MS 诱导碰撞能量为1.0 V。每个样品重复进样两次。
1.4.3 光合速率的测定
选择晴朗无云的上午，利用Li-6400光合仪，对不同砧穗组合叶片（9—10节位）进行光合测定。每个砧穗组合选择6棵长势一致的树体进行测定，每棵树重复测定三次。
1.5 数据分析
标准曲线、平均值和标准偏差计算等均通过 Microsoft Excel 2016软件进行分析；SAS9.4进行单因素方差分析，采用orign9.0 进行图形绘制。
2 结果分析
2.1 不同砧木对‘赤霞珠’物候期的影响
由表2可知，‘赤霞珠’不同砧穗组合的物候期是不同的。其中1103P可以显著推迟‘赤霞珠’的物候期，盛花期与自根苗相比，晚1天，转色初期比自根苗晚2天，直到转色完成时，比自根苗晚4天。而SO4和5A则可以提前‘赤霞珠’的物候期，在盛花期三者物候期相同，但豌豆粒大小时，CS/SO4和CS/5A组合提早2天，转色初期提早4天，转色完成时提早3天。CS/1103P组合的物候期显著晚于CS/5A和CS/SO4组合。
2.2 砧木对‘赤霞珠’葡萄果实理化指标的影响
由图2~图5可知，随着果实不断发育，果汁pH值不断升高，在绿果期（E-L33），CS/1103P和CS/SO4组合显著高于‘赤霞珠’自根苗和CS/5A组合，转色初期CS/SO4组合显著高于自根苗和CS/1103P组合。转色进程中CS/5A组合果汁pH值加速升高，转色完成时CS/5A组合显著高于CS/1103P组合，与CS和CS/SO4组合无显著差异，采收前四种处理无显著差异，在果实成熟期，CS/5A组合果汁pH值最高，CS/1103P和CS次之，CS/SO4组合果汁pH最低。果实整个发育过程可溶性固形物不断积累，绿果期CS/5A和CS/SO4显著高于CS和CS/1103P，转色初期CS自根苗显著高于CS/1103P和CS/SO4，转色完成和采收前CS/SO4组合果实可溶性固形物含量最高，但在成熟期CS/5A和CS自根苗显著高于CS/SO4和CS/1103P组合。果汁可滴定酸浓度不断降低，转色初期CS/5A组合显著高于CS自根苗、CS/SO4组合和CS/1103P组合。转色初期到采收前，CS/SO4组合果汁可滴定酸浓度最低，而成熟期CS/5A组合果汁可滴定酸浓度最低。果实重量不断增加，如图5所示，绿果期、转色初期、转色期和采收前，CS/SO4果实最重，显著高于CS自根苗。成熟期CS/5A最高，显著高于CS/1103P组合，但与CS/SO4和CS自根苗无显著差异。
2.3 不同砧木对净光合速率的影响
不同砧木对‘赤霞珠’净光合速率影响不同。净光合速率随着果实的不断发育，不断增加。由图6可知，在转色完成时，净光合速率达到最大，随后，随着果实继续生长，净光合速率略有下降。在绿果期，CS/5A组合显著高于CS/1103P组合，与CS/SO4和CS自根苗无显著差异。转色初期，CS自根苗和三种砧穗组合无显著差异。转色完成时，CS/5A和CS/1103P显著高于CS/SO4组合。在采收前，CS/1103P光合速率最大。
2.4 砧木对‘赤霞珠’葡萄总花色苷含量的影响
不同砧穗组合的花色苷含量随着果实的发育不断积累增加，如下图所示，在绿果期，3种砧穗组合和‘赤霞珠’自根苗的花色苷含量为0，在转色初期，CS自根苗和三个砧穗组合花色苷含量无显著差异，而在转色完成时期和采收前期，CS自根苗和CS/5A显著高于CS/1103P和CS/SO4组合。在成熟期，CS自根苗和三种砧穗组合花色苷含量无显著差异。
2.5 不同砧木对‘赤霞珠’葡萄总黄酮醇含量的影响
不同砧穗组合的黄酮醇含量随着果实的发育不断积累增加，在绿果期，CS自根苗和CS/5A组合显著高于CS/SO4组合，与CS/1103P无显著差异。转色初期，CS/5A显著高于CS/1103P和CS/SO4组合，从转色完成和采收前期，CS自根苗含量显著高于CS/1103P和CS/SO4组合。而成熟期，CS自根苗和CS/1103P无显著差异，但是都显著高于CS/5A组合。
不同砧木不仅对黄酮醇总含量有所影响，对黄酮醇的比例也有影响。如图所示，CS/5A组合在成熟期，杨梅酮含量最高，CS/SO4组合次之，CS和CS/1103P组合差异较小。对于槲皮素类，CS/1103P和CS/SO4组合高于CS自根苗和CS/5A组合，西伯利亚落叶松黄酮以CS自根苗含量为最高，CS/5A含量最低，对于山奈酚类，整体差异较小，以CS/5A组合最高。对于异鼠李素类，CS/5A和‘赤霞珠’自根苗高于CS/1103P和CS/SO4组合。对于丁香亭类，CS/SO4和CS自根苗高于CS/1103P和CS/5A组合。
3 讨论
本试验发现不同砧木对‘赤霞珠’物候期、果实可溶性固形物、果汁可滴定酸浓度、果汁pH、百粒重、叶片净光合速率、花色苷、黄酮醇等指标都有显著性影响。其中砧木1103P嫁接的‘赤霞珠’葡萄物候期长，成熟期果实可溶性固形物含量低，百粒重小，果汁可滴定酸浓度较高。花色苷含量在转色期积累少于其他砧穗组合，但是在成熟期，与其他砧穗组合无显著差异。对于黄酮醇而言，在果实刚开始发育时期，积累较少，但随着发育进程的推进，黄酮醇含量的积累不断增加，在成熟期其含量仅仅次于自根苗。对于净光合速率，绿果期CS/1103P组合显著高于净光合速率最低，但是从转色初期开始，CS/1103P组合净光合速率一直高于其他砧穗组合，在转色完成时期，CS/1103P光合速率达到最大。之所以产生这种差异，主要是由1103P遗传特性决定的，1103P由冬葡萄和沙地葡萄杂交而来，根系深，长
势旺盛，抗旱能力强，这就决定了在生长期，由光合作用积累的化合物更多的供应营养生长，而用于维持生殖生长的化合物相对较少，进而导致了CS/1103P组合物候期延长，糖类积累较慢，酸含量分解较慢的现象。Massimiliano Corso也有类似的发现。他研究表明，1103P之所以会延长接穗的物候期，与砧木调节生长素的合成有关；通过对CS/1103P和CS/M4两种砧穗组合发育中的浆果的果皮和果肉获得的mRNA-Seq数据进行分析，发现以控制生长素作用的基因为代表的基因，如ARF和Aux / IAA是受砧木基因型影响的主要基因之一。1103P嫁接的‘赤霞珠’在发育过程中，积累的生长素相对较少，因此，发育进程也就相对迟缓。砧木SO4由冬葡萄和河岸葡萄杂交而来，根系浅，长势中庸，净光合速率在前期较高，转色完成以后下降较快。百粒重和果实可溶性固形物，同样是随着发育进程的进行，由领先变为落后。对于黄酮醇和花色苷的积累，CS/SO4组合低于其他组合。这些理化指标由初始阶段的高于其他组合，变为后期低于其他组合，可能是SO4作为提早‘赤霞珠’发育期的一种补偿。对于砧木5A，亲本不明确，对‘赤霞珠’的影响，整体情况与SO4类似，都提早了接穗的发育期，提高了果实的百粒重，成熟期黄酮醇含量与CS/SO4组合无显著差异，但显著低于自根苗和CS/1103P组合，至于其中的原理，目前尚不清楚。
4 结论
砧木1103P显著推迟了‘赤霞珠’的物候期，减慢了糖的积累和酸的分解，净光合速率高，对成熟期的花色苷和黄酮醇含量无显著影响。砧木5A可显著提高‘赤霞珠’百粒重，降低pH，并且降低黄酮醇的含量。砧木SO4提早了‘赤霞珠’的物候期，对于花色苷和黄酮醇的积累影响较小。
砧木对花色苷的积累在发育过程中会有差异，但是在成熟时，砧木对接穗无显著影响。不同砧木对黄酮醇的总含量以及不同类型黄酮醇比例有显著影响。