石家庄综合试验站

  摘　要：NAC 转录因子对果实发育及成熟过程起到重要的调控作用。本研究采用维多利亚为试材，参考Wang等与本课题转录组测序得到的数据，筛选了11个NAC转录因子作为研究对象，发掘与果实成熟相关的转录因子。结果表明，结果表明果实发育成熟的过程中，NAC17、NAC21/22、NAC29、NAC72、NAC100的表达量变化较大，推测可能与果实发育成熟密切相关。

  关键词：葡萄；NAC转录因子；发育成熟

  NAC转录因子是近10年来新发现的具有多种生物功能的植物特异转录因子，为植物中最大的转录因子家族之一，该家族最主要的结构特点是其N端含大约150个高度保守的氨基酸组成的NAC结构域。2004年，Ernst等通过实验证明NAC结构域是一种新的转录因子折叠结构，其不含经典的螺旋-转角-螺旋结构，而是由几个螺旋环绕一个反向平行的β -折叠而成。

  目前，在拟南芥、水稻、葡萄、白杨、大豆和烟草等植物材料中分别鉴定了 117、151、79、163、152和152NAC转录因子新成员。NAC转录因子在植物生物和非生物胁迫应答、激素信号途径的转导、机体的凋亡等方面发挥着重要的作用。在拟南芥、番茄等模式作物上有关 NAC 转录因子调控果实成熟的研究较多，拟南芥中与果实成熟相关的 NAC 基因已有报道，乙烯合成前体 ACC 可以诱导乙烯信号转导途径中的下游转录因子基因AtNAC2。在拟南芥中发现的 NAP转录因子（NAC-Like，受 AP3/PI激活）在调控植物生长发育、叶片衰老、响应生物和非生物胁迫等方面有重要作用，NAP 转录因子不仅与叶片衰老有关，也与果实衰老紧密相关。

  L i u 等在奉节脐橙（Citrussinensis Osbeck）晚熟突变体中发现了 1 个 NAC 基因 citNAC， 其在成熟柑橘的果皮和果肉中表达较高，而在果实发育的其他阶段表达量相对较低，该基因的表达模式预示它可能与果实的成熟和组织的衰老密切相关。转录因子 Aa/AcNAC1/2/3/4 在软枣猕猴桃（Actinidia arguta）及中华猕猴桃（Actinidia chinensis）成熟期果实中表达均高于采收期；AaNAC2/3/4 可以直接结合萜类合酶基因 AaTPS1 的启动子，AcNAC2/3/4 不能结合 AcTPS1 的启动子，其结果导致这两种猕猴桃果实的风味品质具有明显的差异。对柿果实的研究表明，DkNAC1、DkNAC3、DkNAC5 及 DkNAC6的表达量与果实脱涩程度显著相关。研究发现，枇杷果实的木质化进程需要 EjNAC1 调控 EjPAL1 和Ej4CL1 的表达才能实现。

  近年的研究表明，NAC 转录因子对果实发育及成熟过程起到重要的调控作用。本研究采用维多利亚为试材，参考Wang等与本课题转录组测序得到的数据，筛选了11个NAC转录因子作为研究对象，发掘与果实成熟相关的转录因子，对果实成熟机理进行深入研究，为揭示 果实成熟发育调控及其机理提供理论依据。

  1　材料与方法

  1.1　植物材料

  试验于2019年在石家庄果树研究所葡萄示范园进行。选取5年生维多利亚为试材，南北行向，高干T型架，株行距，行间自然生草，选择树势中庸的植株，植株 2019年5月上旬开花，每结果枝留1穗果，人工进行疏花疏果，保证穗型一致，田间肥水与病虫害防治按照葡萄园常规管理措施进行管理。本试验于分7个时期采果，分别为5月28日（T1）、6月10日（T2）、6月17日（T3）、6月24日（T4）、7月7日（T5）、7月15日（T6）、7月22日（T7），取样方式为采集3穗果实，均匀从每穗的上中下剪取果粒，选取一部分样品测定单果质量，然后选取50-70粒果实存放于自封袋内，做好标记，立刻液氮速冻，在超低温冰箱（-80℃）保存备用。

  1.2　试验方法

  1.2.1　单果重、糖、酸物质测定

  随机选取20粒果实，利用电子天平称重并求得单果重量。

  1.2.2　样品处理及其糖酸提取

  随机选取20粒果实，利用粉碎机打成匀浆，并用纱布过滤，抽取5mL果汁8000r/min离心10min，上清液备用。

  糖提取：有机酸提取参考王海波等的方法略有改动， 吸取1ml上清液，水稀释10倍后，经 0.45μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤，待测。利用色谱柱为ZORBAXCarbohydrate（4.6×250mm， 5 μ m ） ， 流动相为乙腈— 水（85:15）溶液，柱温30℃，流速为0.8ml/min，进样量20μL。检测器为示差检测器。

  酸提取：有机酸的提取参考王海波等的方法略有改动，抽取1ml上清液，流动相稀释10倍后，经0.45μm Sep-Pak水系微孔滤膜过滤，待测。利用安捷伦色谱柱为Agilent SB—AQ（4.6×250mm，5μm），流动相为甲醇—10mMK2HPO4（5:95）溶液，用磷酸调节pH值至2，柱温25℃，流速为0.5ml/min，进样量10μL。检测器为可变波长紫外检测器（AgilentV W D G 1 3 1 4 B ） ， 检测波长210nm，3次重复。

  试验所用葡萄糖、果糖、蔗糖、草酸、酒石酸、苹果酸和柠檬酸均购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司（TCI）。

  1.2.3　果实总RNA的提取与cDNA合成

  使用植物总RNA提取纯化试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取不同时期果实的总RNA。用1.0%凝胶电泳检测RNA质量。使用Revert Aid First StrandcDNA Synthesis Kit试剂盒（Thermoscientific公司）将提取的RNA反转录成cDNA。

  1.2.4　 NAC转录因子表达分析

  参考Wang等与本课题转录组测序得到的数据，筛选了11个NAC转录因子作为研究对象，参考NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）基因序列，采用在线设计工具Primer-BLAST设计引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表）。

  以维多利亚不同时期的cDNA为模板，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂（TaKaRa公司）进行PCR扩增。qPCR 体系为：cDNA模板3.5μL，上下游引物各0.4μL，Mix10μL，ddH2O 5.7μL。qPCR程序为：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃延伸1min，共循环40次，在65℃-95℃进行溶解曲线分析。以actin 的表达水平为内参，基因的相对表达量按BIO-RAD CFX荧光定量仪使用说明进行分析。以维多利亚第一时期作为对照，即表达量为1，数据使用Origin 9.0软件进行处理。

  2　结果与分析

  2.1　果实糖酸含量分析

  在维多利亚果实坐果到成熟的过程中，单果重呈逐渐升高的趋势，其中从5月28日（T1）到7月7日（T5）增长速度较快，7月7日（T5）以后缓慢增长，并趋于稳定。可溶性固形物逐渐升高，直到成熟。

  在果实发育过程中，检测到的糖组分主要是葡萄糖、果糖，含量随着果实发育逐渐升高。发育期间果实内葡萄糖的含量均高于果糖，成熟期葡萄糖占总糖的63.37%，属高葡萄糖型。另外，发育期间并未检测到蔗糖。

  2.2　NAC转录因子的表达分析

  为明确NAC转录因子与果实发育成熟的关系。通过实时荧光定量PCR技术对维多利亚果实花后7个时期的NAC转录因子表达量进行分析。结果表明，NAC2、NAC53、NAC54、NAC55、NAC68、NAC83的表达量变化较小（最大值小于2.5）；NAC17、NAC21/22、NAC29、NAC72、NAC100的表达量变化较大，推测可能与果实发育成熟密切相关。同时，这5个NAC转录因子在果实发育成熟阶段出现不同的变化。NAC17、NAC21/22、NAC29、NAC72在发育中区出现高峰，随后表达量逐渐降低。尤其在6月17日（T3）左右，NAC17、NAC21/22、NAC29 的表达均出现高峰，NAC21/22的表达量最高，为52.92；然而，NAC100表达量随着果实的发育成熟逐渐呈升高趋势，在成熟果实中表达量最高。

  综上所述， 推测NAC17、NAC21/22、NAC29、NAC72、NAC100可能与果实发育成熟密切相关。但5个转录因子出现了2种不同的表达模式，可能是基因的作用机制不同所致。

  3　结论

  NAC转录因子对果实发育及成熟过程起到重要的调控作用。为明确NAC转录因子与果实发育成熟的关系，本研究采用维多利亚为试材，参考Wang等与本课题转录组测序得到的数据，筛选了11个NAC转录因子作为研究对象，发掘与果实成熟相关的转录因子。结果表明果实发育成熟的过程中，NAC17、NAC21/22、NAC29、NAC72、NAC100的表达量变化较大，推测 可能与果实发育成熟密切相关。