果实病害防控岗位

  葡萄酸腐病主要在葡萄果实发育中后期发生，主要症状为果实破裂处果肉软化腐烂，有汁液流出，并有明显醋酸气味。近几年该病逐年加重，已成为葡萄果实的重要病害之一。目前研究认为该病害主要由酵母菌和醋酸细菌混合侵染造成，其中醋酸细菌更为重要（Barata et al., 2008; Barata et al.,2012a），近几年也有报道认为部分丝状真菌参与病害发生（Pisaniet al., 2015）。此外，昆虫传播也是引起葡萄酸腐病流行的必要因素（Hall et al., 2018）。

  许多昆虫的某些发育阶段会在葡萄果树上活动或取食（Buchananand Amos, 1992）。昆虫活动对葡萄上微生物群体有重要影响，并进而影响酸腐病的发生。果蝇（主要是黑腹果蝇）是造成酸腐病最重要的昆虫媒介。果蝇可携带酵母以及醋酸细菌（主要包括醋酸杆菌属（Acetobacter ）、葡糖酸醋杆菌属（Gluconacetobacter ）、葡糖杆菌属（G l u c o n o b a c t e r）、Commensalibacter ）等。酵母或者醋酸细菌可以为果蝇幼虫提供营养物质，与果蝇互利共生，而果蝇又可以传播酵母及醋酸细菌（Barata etal., 2012a; Hall et al., 2018）。

  葡萄酸腐病的发生，首先是由于生物因素（昆虫、鸟类及真菌）或非生物因素（雨水、冰雹及葡萄果实膨胀）使得葡萄表皮产生破损，若无果蝇存在，植物自身防御反应可以使伤口愈合，若果蝇将酵母菌与醋酸细菌传播至表皮破损处，酵母菌在伤口处繁殖，产生乙醇，同时葡糖杆菌与葡糖酸醋杆菌也在伤口处繁殖并产生葡萄糖酸与醋酸，最后醋酸杆菌将乙醇氧化为高浓度醋酸。此过程中产生的挥发性物质吸引更多果蝇，果蝇进一步将醋酸细菌与酵母传播至其他受伤的果实，造成酸腐病流行（Barataet al., 2012a）。

  已有一系列工作对葡萄果实中的酵母菌以及醋酸细菌进行分析，大多数研究采用平板涂布的方法进行检测（Barata et al., 2008; Barbeet al., 2001）。平板检测的方法相对于荧光定量PCR（quantitativePCR，qPCR）费时较长，且需对所分离菌落做进一步鉴定（Barataet al., 2012b）。有报道利用qPCR技术对健康和腐烂葡萄果实中的酵母菌和醋酸细菌进行定量检测，所得两种微生物群体显著高于平板检测所得结果，甚至部分样品平板检测醋酸细菌呈阴性，qPCR与高通量测序结果均呈阳性，这可能是由于部分醋酸细菌进入存活但不可培养状态（viable but non-culturablestate, VBNC）且平板法灵敏度较低导致检测结果呈阴性（Lleixà et al.,2018）。目前尚无研究对果蝇体内酵母菌及醋酸细菌进行qPCR定量检测。

  本课题组近期建立了酵母菌及醋酸细菌的qPCR定量检测体系，并计划在后续实验中对果蝇及葡萄果实上的靶标菌群进行检测。根据文献中有关酵母和醋酸细菌PCR检测的报道，筛选得到酵母菌及醋酸细菌的特异性引物（表1）。

  分别建立标准曲线。具体做法为：将特异性引物对所扩增片段克隆至pMD18-T载体，EcoRⅠ酶切，凝胶回收，测定浓度，计算得到拷贝数浓度，依次十倍系列稀释，作为qPCR模板来进行体系优化与标准曲线构建（图1）。

  得到醋酸细菌qPCR定量检测标准曲线y = -3.46x + 33.22，R2 =0.99，PCR 效率为95%，体系灵敏度为每个反应体系500个醋酸细菌16S rDNA片段。

  得到酵母菌qPCR定量检测标准曲线y = -3.75x + 34.55，R2 =0.99，PCR 效率为85%，体系灵敏度为每个反应体系500个酵母菌23SrDNA片段。

  葡萄果实和果蝇携带酵母和醋酸细菌的qPCR检测正在进行中。